1. Técnicas de
Inmunohistoquímicas

2. Introducción
 ¿Que es la Inmunohistoquímica?
• Topología
• Inmunología
• Bioquímica

3. Introducción
 ¿Cual es su historia y su relación con la
inmunofluorescencia?
• 1871 Baeyer. Demostración de la unión del Rin y el Danubio (Fluoresceina)
• 1941 Coons Inmunofluorescencia (isocianatos: -N=C=O)
• 1949 Struggers. Utilización del Naranja de acridina en Microscopía de
Fluorescencia
• 1958 Riggs. Inmunofluorescencia (isotiocianatos –N=C=S)
• 1966 Nakane, 1969 Avrameas. Marcado por Peroxidasa de Rábano picante.

4. Desventajas de la IF
 Requiere de Microscopio de luz UV
 Material fresco o especialmente procesado
 Conservación corta de la muestra
 Cito morfología poco definida
 Decaimiento de la fluorescencia con el tiempo

5. Fundamentos de la IHQ
Para comprender mejor el potencial de los métodos de coloración de IHQ,
así como los problemas latentes que pueden estar asociados con los mismos
es necesario tener un conocimiento básico sobre:

6. Fundamentos de la IHQ
 IgM y la inmunización
 IgG y la Hiperinmunización
 Vida media de las Ig

7. Fundamentos de la IHQ
 Anticuerpos Policlonales
• Especies: conejo, cabra, cerdo, equino
• Facilidad del mantenimineto
• ATC humanos contra proteínas de conejo
son menos frecuentes que para otras
especies
• Los ATC de conejo precipitan mejor
proteínas humanas
• Pools de varios conejos no generan
variaciones en las partidas
• Vías y dósis de inoculación
• Purificación: antisueros o fracción de Ig

8. Fundamentos de la IHQ
 Anticuerpos Monoclonales
• Características
• Producción de monoclonales
• Ventajas: homogeneidad, auscencia de
inespecificidad, ausencia de variabilidad
entre partidas, facilidad en la caracterización
• La especificidad: el epitope debe ser único en
el ATG

9. Fundamentos de la IHQ
 Afinidad entre Anticuerpos
• Afinidad intrínseca: Fuerzas iónicas, de van der Waals, enlaces de H+
• Afinidad funcional: Concentraciones iónicas, T °C, agitación, tiempo
de incubación
 Reactividad cruzada entre Anticuerpos
• Entre ATC y dos o mas ATGs
• Entre un ATg y varios ATCs diferentes
• Reactividad cruzada interespecifica y su aplicación científica

10. Fundamentos de la IHQ
 Estabilidad de los Anticuerpos
• Métodos de Purificación: PH, concentraciones salinas,
ATC conjugados con glutaraldehido
• Métodos de Almacenaje.
 Manejo de los Anticuerpos
• Envases adecuados
• Temperatura de almacenaje

11. Fundamentos de la IHQ
 Título de los Anticuerpos
• El concepto de la dilución máxima
 Dilución de los Anticuerpos
Estreptoavidina-
HRP
Diluciones del ATC Primario
1:50 1:50 1:100 1:200
1:100 1:50 1:100 1:200
1:200 1:50 1:100 1:200
• Tiempo de incubación
• Temperatura de incubación

12. Fundamentos de la IHQ
 Enzimología: Concepto
E +S E.S P + E
Px + H2O2 Px.H2O2 + DAB (cromógeno)
Molécula coloreada + Px + H2O

13. Fundamentos de la IHQ
 Peroxidasa (HRP)
• Tiene un grupo hematina
• Se inhibe por exceso de sustrato
• Cuando se combina con H2O2 libera O2 molecular
 Fosfatasa alcalina (AP)
• Transfiere grupos fofato
• No es interferida por la actividad endógena de la perxidasa
• La actividad de fosfatasa alcalina endógena se bloquea con
Levamisol

14. Fundamentos de la IHQ
 Sustratos de la Peroxidasa
• 3, 3´diaminobenzidina DAB)
•3-amino-9-etilcarbazol (AEC)
• 4-chloro-1-naftol (CN)
• P-fenilendiamina dihidroclorhidrico
 Sustratos de la Fosfatasa alcalina
• naftol AS- fosfato
• la fuccina nueva
• AS-Bi fosfato
• 5 bromo-4-cloro 3-indoxil fosfato (BCIP)
• Fast red
• Nitro Blue

15. La Fijación
 La fijación como modificación de la
estructura antigénica
• Coagulación de proteínas
• Formación de puentes metileno entre aminoácidos básicos
 Tipos de fijadores
• Extendidos de sangre
• Extendidos citológicos
• Cortes de críos tato
• Cortes de Parafina
• Microondas

16. La Fijación
 La Recuperación Antigénica
• El uso de enzimas digestivas
• El uso de soluciones de metales o de citrato alternando con calor
• El uso del calor y presión
• Usos combinados
• La AR en la hibridación in situ

17. Metodos de Coloración
 El Método Directo
 El Método Indirecto

18. Métodos de Coloración
 Método indirecto de tres pasos
 Técnicas de Complejos
Inmune Solubles de Enzima

19. Métodos de Coloración
 Técnica de (Estrept) Avidina - Biotina
 Técnica de LSAB

20. Métodos de Coloración
 Técnica ABC utilizando la amplificación
catalizada de señal (ACS)

21. Métodos de Coloración
 Tecnología de Polímeros Conjugados
Metodo EPOS
• Polímero de Dextrán
• 70 moléculas de Enzima
• 10 moléculas de ATC 1rio
Metodo EnVision
• ATC 2rio unido al polímero de Dextrán
• No usan (estrept)avidina biotina
• Se reduce el tiempo de incubación
• Mayores diluciones de ATC

22. Métodos de Coloración
Sistema EnVision para la marcación simultánea de varios ATG tisulares

23. Métodos de Coloración
 Los Controles
Para determinar la especificidad de un policlonal es mejor reemplazarlo
con un antisuero preabsorbido o una fracción de Inmunoglobulina.
• Concentración de proteína de la fracción IgG
4.8 g/l, Dil. 1:200. Concentración final: 4.8/200= 0.024g/l
• Fracción de IgG no inmune de conejo
20g/l, Dil. 20 g/l / 0.024 = 833
• Dilución de control negativo de Reactivo:
1:833
Los controles de Reactivo

24. Métodos de Coloración
Los Controles de Tejido
• Controles de tejido Negativos
• Controles de tejido Positivos
• Controles de Tejido Internos
Los Controles de Técnica
• Controles negativo de ATC 1rio
• Controles negativo de ATC 2rio

25. El Fondo
 Interacciones Hidrofóbicas

26. El Fondo
 La actividad de enzimas endógenas

27.  Interacciones por difusión de ATG
El Fondo
• Difusión de Antígeno
• Difusión de proteínas de plasma

28.  Interacciones Misceláneas
El Fondo
• Por fijación inadecuada • Células aplastadas