O documento descreve a técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), incluindo seus componentes, aplicações e variações. A PCR permite copiar DNA in vitro e foi desenvolvida em 1984, revolucionando a biologia molecular. Sua importância é comparada à descoberta da estrutura do DNA.
PCR - Reação em cadeia de polimerase: princípios, aplicações e variações da técnica
1. Centro Universitário - UNIBRASIL
PCR
Reação em Cadeia de
Polimerase
Professora: Lyia
Alunas: Aldiny Paula
Kamelyn Casagrande
4BMAD
2. PCR – consiste em fazer cópias de DNA “in vitro”,
usando os elementos básicos do processo de
replicação natural do DNA.
PCR alcançou objetivos bem mais amplos que os
propostos inicialmente. PCR é comparada em
importância à definição da estrutura do DNA.
3. 1984 - PCR foi apresentada pela primeira em
um encontro científico
Publicação:
Mullis and Faloona, 1987
Saiki at al. 1988
1976: Thomas D. Brock descobriu a DNA polimerase
termoestável de Thermus aquaticus.
1988: Esta DNA polimerase foi usada por Saiki para
fazer PCR.
4. PCR requer 7 componentes essenciais:
- DNA polimerase termoestável
- Um par de oligonucleotídeos para iniciar a síntese
de DNA
- Deoxinucleotídeos trifosfato (dNTPs)
- Cátion divalente: toda DNA pol. requer cátion
divalente, usualmente Mg2+
- Tampão para manter o pH
-Cátions monovalentes, usualmente K+ (KCl)
- Template de DNA
5.
6. Considerações
-Validade dos reagentes
-Número de congelamentos e
descongelamentos
-Contaminação (cabelos, pele...)
-Pureza (1,8 valor de referência,
espectrofotômetro)
-Quantidade de material genético
–Pouco: pouca amplificação
–Muito: pouca amplificação
Abs 260
P= ________
Abs 280
7. PCR é um processo iterativo, consistindo de
três elementos:
1- Desnaturação da template por aquecimento
2- Pareamento dos iniciadores à sequência alvo fita
única
3- Extensão dos iniciadores pela DNA polimerase
termoestável
8. Cada uma das novas fitas de DNA estendidas a partir
dos “primers” serve como template para síntese de
uma nova fita. Os “primers” presentes na reação
fazem o pareamento com as novas fitas, na região de
complementariedade antiparalela entre “primer”-
“template”. Isso garante a aumento exponencial do
número de novas fitas.
Todas as fitas de DNA sintetizadas durante a PCR
têm a sequência de um dos primers na extremidade 5’
e a sequência complementar ao outro primer na
extremidade 3’
9.
10.
11. Fases da PCR:
1ª Fase: Aquecimento a mais
de 90ºC para a separação da
dupla fita
Separa tanto a Fita de DNA original quanto os
produtos de amplificação
2ª Fase: Anelamento dos primers
Hibridização
Temperatura varia entre 40 a 70ºC conforme o par de
primers
Determina a especificidade da ligação
12. 3ª Fase: Extensão dos primers - duplicação do DNA
Temperatura ótima em torno de 72ºC
Ao final da reação, a quantidade de DNA amplificado
em relação ao DNA inicial é igual a 2n, sendo que n=
número de ciclos da PCR
Exemplo: PCR de 29 ciclos: 229= 536.870.912 cópias
para cada fita original
13. 1989 - DNA Thermal Cycler, primeiro termociclador
automático
14.
15. Efeito Plateau: desvio da quantidade teórica
>>Perda da atividade da Polimerase
>>Acúmulo de inibidores
>>Limitação dos componentes
>>Competição entre produtos
>>Pareamento Produto x Molde
>>Competição com anelamento do primer
17. PCR que ocorre dentro de uma célula em lâmina.
Pode ser realizada em células ou tecidos fixados.
18. Variação da PCR
Convencional, na qual são
utilizados 2 pares de
primers (ao invés de um
par), para amplificar um
mesmo fragmento.
2 Pares para amplificar
um mesmo fragmento
19. PCR com 2 ou mais conjuntos de primers para
amplificar diferentes fragmentos de uma mesma
amostra.
Amplificar diferentes
fragmentos de uma
mesma amostra
20. Real Time – PCR
-Detecção, amplificação e quantificação numa única
etapa (agilidade na obtenção de resultados)
-É uma ótima técnica quantitativa e muito utilizada
atualmente
-Utiliza Mix comerciais como reagente
Metodologia da PCR
+
Detecção de sinais
fluorescentes
21.
22. PCR: Aplicabilidade
- diagnóstico médico (Polimorfismos)
- mapeamento genético
- detecção de doenças hereditárias
- clonagem de genes
- testes de paternidade
-criação de organismos transgênicos
-Genética forense
23. Real Time – PCR:
-Todas as aplicações da PCR tradicional
-Quantificação de Carga Viral
-Quantificação de Expressão gênica
-Testes de Eficiência terapêutica
-Detecção de Agentes Infecciosos
-Caracterização de Agentes (Genotipagem)
24. Doença de Alzheimer
-Genes da proteína β- amilóide
(PPA,cromossomo 21) e
-Da proteína apolipoproteína E
(APOE, cromossomo 19) >> PSEN1, PSEN2, TNF-a,
o PSEN1 e o CYP46
25. Referencias utilizadas:
BOTELHO, Ingrid Thaís Beltrame .Reação em cadeia da Polimerase.
UFSC. Disponível em:<http://proto.ufsc.br/files/2012/03/PCR.pdf> .Acesso
em:26/10/2015
VIEIRA, Daniel Perez. Técnicas de PCR: Aplicações e Padronização de
Reações. Disponível em:< http://etallcorp.xpg.uol.com.br/aula3.pdf>.
Acesso em:27/10/2015