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Culture in vitro des plantes

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Les techniques de culture in vitro cherchent à contrôler les facteurs de l’environnement (température, lumière, composition du milieu…) du fragment de plante mis en culture afin de l’orienter vers un …

Les techniques de culture in vitro cherchent à contrôler les facteurs de l’environnement (température, lumière, composition du milieu…) du fragment de plante mis en culture afin de l’orienter vers un programme d’évolution déterminé.

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  • 1. Elaboré par : DELLAA Ahmed
  • 2. Les biotechnologies végétales reposent principalement sur lescultures in vitro.
  • 3. Les applications sont nombreuses aujourd’hui tant dans le domaine de l’horticulture que dans celui de la recherche (notamment en amélioration des plantes), ou encore pour conserver la diversité variétale (Conservatoires) ou sauvegarder des espèces menacées.Les techniques de culture in vitrocherchent à contrôler les facteurs del’environnement (température,lumière, composition du milieu…) dufragment de plante mis en cultureafin de l’orienter vers un programmed’évolution déterminé.
  • 4. Dès 1902, Haberland, un biologiste allemand, observe les potentialitésnaturelles de la multiplication végétative (bouturage). Suite à ces travaux, ilénonce le premier grand principe qui ouvrira la voie de la micropropagationdes végétaux. Il s’agit du principe de la totipotence cellulaire.
  • 5. En 1934, WHITE réussit laculture de racines de tomatesur un milieu contenant de leau, des sels minéraux ,unextrait de levure et du sucreet une hormone végétale, laseule connue à l’époque :l’auxine.En 1939, Gautheret obtient à partirde tissu carotte, un amas decellules dédifférenciées : un cal.On peut cultiver ce calindéfiniment dans le temps. Aveclui démarre vraiment laculture in vitro ("dans du verre").
  • 6. Il s’agit un ensemble de méthodes faisant intervenir dune part lasepsie(stérilisation du matériel, désinfection des explants) : Autoclave: sert a la stérilisation des Hotte a flux laminaire : travail Milieux de culture et du matériel. en condition aseptiques.
  • 7. dautre part des conditions de culture parfaitement contrôlées (milieux deculture définis pour chaque type de plante, température, lumière,humidité,...).
  • 8. Ces méthodes sappliquent des organes ou des fragments d’organes :les explants. - graine immature, - embryon, - ovule, - pollen, - bourgeon terminal, - bourgeon axillaire, - morceau de tige, - morceau de feuille, - de pétale de fleur, - etc....
  • 9. Lexplant doit trouver dans le milieu de culture tout ce dont il a besoinpour survivre, se multiplier et éventuellement régénérer un nouvelindividu, en fait, tout ce que la plante mère peut fournir : par les racines : les éléments minéraux, l’eau ; par les feuilles et grâce à la photosynthèse : des sucres, des vitamines et des acides aminés ;les hormones, pour orienter la formation des organes.
  • 10. A- LES ÉLÉMENTS MINÉRAUX : Macroéléments (g.l-1) Microéléments (mg.l-1) (N), (Ca), (K), (Fe), (Cu), (Zn), (S), (Mg), (P) (Mn), (Mo), (B) (Cl), (Co), (Ni), interviennent en grande ne sont nécessaires à la quantité 6 éléments présents plante quen faibles à des concentrations élevée concentrations, leur rôle est essentiel.
  • 11. B) LES ELEMENTS ORGANIQUES : sucres vitamines acides aminés Dès lors, on ajoute Lemploi de diverses Il a parfois été observé des sucres, le plus vitamines favorise que lapport dacides souvent du fréquemment le aminés favorisait la saccharose, aux développement des prolifération. milieux de culture pour fournir à lexplant cultures in vitro une source de carbone.
  • 12. C) LES REGULATEURS DE CROISSANCE. Appelés généralement hormones végétales , ils induisent les phénomènes de croissance et de néoformation des organes. On trouve ces substances de croissance naturellement dans toutes les plantes. Les hormones utilisées sont principalement : les auxines*, les cytokinines*, car ces hormones sont capables d’orienter les explants vers la formation de nouveaux organes.* Les cytokinines ont été découvertes par le * En effet, en 1934, on découvre l’auxine (AIA) :biais de la culture in vitro en 1956. Ce groupe il faut 100 kg de maïs immature pour obtenirde substances de croissance végétales est 500 mg d’AIA. Cette substance naturelle estresponsable des divisions cellulaires. Les principalement synthétisée dans les partiescytokinines sont principalement synthétisées apicales et agit sur l’élongation des cellulesdans les parties racinaires jeunes. donc sur la croissance des plantes.
  • 13. Le rapport auxines / cytokinines détermine le devenir des tissus en culture.Notion de balance hormonale Cytokinines bourgeons Auxine formation de racines [ ] égales division cellules indifférenciées
  • 14. En 1962, Murashige et Skoog étudient la multiplication végétativedu tabac et mettent au point le premier milieu de base pour la culture invitro. Ce milieu contient des sels minéraux, des sucres, des vitamines B,des auxines et des cytokinines.Ce milieu rend possible la culture et la prolifération de méristèmesde tiges jusqu’alors réfractaires à la multiplication végétative in vitro.
  • 15. 4 étapes de culture La mise en œuvre Multiplication in vitro Enracinement Acclimatation
  • 16. SAUVEGARDE DES ESPECES EN DANGER. EXEMPLE : LES PLANTES CARNIVORES.MULTIPLICATION D’ESPECES DIFFICILES A OBTENIRPAR DES METHODES TRADITIONNELLES.Enfin, les cultures in vitro permettent de mettre plusrapidement sur le marché les plants certifiés, lesnouvelles créations, ou encore dassainir des collections.
  • 17. Obtention de clones sélectionnés pour leur vigueur, leur caractèresintéressants (Chrysanthème, Fraisier, Bananier), leur rareté (Orchidées)Assainissement des végétaux (plantes sans virus)Production rapide et en masse, à nimporte quel moment de lannéeRaccourcissement des cycles de développement
  • 18. Diminution des coûts de production (peu de personnel) et des dépensesénergétiques ( réduction des surfaces de culture et éclairement réduit)Facilité de stockage et conservation (au froid) de millions de plantes sur detrès petites surfaces, à létat sain et à labri des contaminations
  • 19. Production de substances biochimiques intéressantes pourlindustrie
  • 20. Culture de méristème Meristème Apex caulinaire Plantules Tige feuillée Enracinement Nœud Caulogenèse directe Morphogenèse Embryogenèse Semences directe somatique directe artificielles Explants divers Caulogenèse (racines, tige, feuilles…) indirecte cal Morphogenèse Embryogenèse indirecte somatique Callogenèse indirecte SuspensionsD’après Lindsey et Jones 1989 cellulaires
  • 21. Les embryons obtenus après la fécondation peuvent être prélevés, mis enculture in vitro et donner un nouvel individu. Le sauvetage dembryonsconsiste à prélever un embryon précocement, pour le cultiver in vitro, soitpour accélérer les cycles végétatifs, soit parce quil ne pourrait pas sedévelopper dans les tissus maternels, par exemple lorsquil résulte duncroisement interspécifique.
  • 22. Le processus dhaplodiploïdisation comprend lobtention de planteshaploïdes à partir des organes porteurs des cellulesreproductrices, appelés gamétophyte mâle ou femelle, et le retour versla phase diploïde.
  • 23. La propriété la plus importante des protoplastes est leur capacité à fusionner entre eux lorsquils sont placés dans un milieu approprié. Cette technique permet de surmonter les barrières liées à la reproduction sexuée et de créer de nouvelles combinaisons entre noyau et cytoplasme.Du fait de labsencede la paroipectocellulosique,lintroduction directede lADN dans lescellules est facilitée.
  • 24. Une source de gènes étendue.On peut franchir la barrière desespèces, des genres et desrègnes. Ainsi, il est possibledintroduire des caractères quilne serait pas possibledintroduire par sélectionclassique.Le transfert dun gène précis.Elle permet de transférer le seul gène désiré et non detransférer plusieurs gènes comme lors de lareproduction sexuée.
  • 25. Etape 1 Etape 2 Etape 3 Etape 4
  • 26. Etape 1 Etape 2 Etape 3 Etape 4Identifier, isoler, intégrer et multiplier un gène dintérêtLa première étape estlidentification dun caractèreque lon veut introduire dansla plante, comme par exempledes caractères de qualiténutritionnelle, la résistance àcertains insectes, à certainesmaladies, à desherbicides, etc. Le gènedintérêt peut provenir de toutorganismevivant, plante, animal oubactérie puisque le codegénétique est universel.
  • 27. Etape 1 Etape 2 Etape 3 Etape 4Identifier, isoler, intégrer et multiplier un gène dintérêtIl doit ensuite être isolé delorganisme donneur. Il estintégré dans une constructiongénétique associant souventun gène marqueur. Ce gènemarqueur permet desélectionner les cellules quiont intégré le gène dintérêt.La construction est ensuitemultipliée (clonée) afin dedisposer dune quantitésuffisante dADN pour sonintroduction dans les cellulesvégétales que lon veut transformer.
  • 28. Etape 1 Etape 2 Etape 3 Etape 4 Transférer le gène La transformation biologique
  • 29. Etape 1 Etape 2 Etape 3 Etape 4 Transférer le gèneLa transformation biologique.La transformation génétique estréalisée en mélangeant uneculture dune souchedAgrobacterium transformée,mise en suspension en milieuliquide, avec des explants de laplante, on parle de coculture.Cest au cours de cette étapeque la construction génétiqueintroduite dans la bactérie esttransférée dans le génome de laplante.
  • 30. Etape 1 Etape 2 Etape 3 Etape 4 Transférer le gèneLa transformation biologique. La coculture est lavée pour éliminer les agrobactéries. Il faut ensuite sélectionner les cellules qui sont effectivement transformées. Pour cela, on apporte dans la culture des explants un agent sélectif approprié : herbicide, antibiotique ... Seules les cellules végétales transformées, cest-à-dire celles possédant et exprimant le gène marqueur de sélection, soit de résistance à un herbicide, soit de résistance à un antibiotique, pourront se développer.
  • 31. Etape 1 Etape 2 Etape 3 Etape 4 Transférer le gène Le transfert direct.Des méthodes dites detransfert direct utilisent desmoyens physiques ouchimiques pour permettre lapénétrationdADN, généralement sousforme de plasmides dans unecellule végétale. Les plusutilisées sont la biolistique et letransfert sur protoplastes.
  • 32. Etape 1 Etape 2 Etape 3 Etape 4 Régénérer et évaluer les plantes transforméesAprès sélection des cellulestransformées, il faut régénérer lesnouvelles plantes transgéniques.Les cellules transformées sedéveloppent dabord encals, larges amas de cellulesindifférenciées. Après quelquessemaines, on observe ledéveloppement de pousses. Ellessont alors placées dans unnouveau milieu de culturepermettant le développement desracines. Quand les racines sontsuffisamment développées, lesplantules sont repiquées en pot etacclimatées en serre.
  • 33. Etape 1 Etape 2 Etape 3 Etape 4 Régénérer et évaluer les plantes transforméesLes cellules transformées est uneétape difficile à maîtriser. Aussi,le génotype, le type de tissus etles conditions de culture sontchoisis en fonction de leuraptitude à la régénération.Les plantes régénérées sontensuite analysées pour confirmerlinsertion de la constructiongénétique dans leur génomearégénération in vitro des.
  • 34. Etape 1 Etape 2 Etape 3 Etape 4 Incorporer dans une variété commerciale Les plantes transformées obtenues sont soumises à des croisements contrôlés pour étudier les modalités de transmission du nouveau caractère à la descendance.

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