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Meio de cultura em microorganismos
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Meio de cultura em microorganismos

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  • 1. Exigências nutricionais e meio de cultura em microorganismos Prof. Dra. Adriana Dantas UERGS, Bento Gonçalves, RS
  • 2. Nutrição e crescimentoNutrição microbiana Componentes necessários às células Meios de cultura Condições ambientaisCrescimento populacional Velocidade de crescimento Tempo de geração Medidas do crescimento
  • 3. Proliferação de Microrganismos As bactérias são microrganismos unicelulares com uma estrutura muito simples, o que lhes permite replicarem- se muito rapidamente caso encontrem nutrientes, temperatura, pH, humidade e concentração de oxigénio favoráveis. Alguns casos, apenas 20 minutos são suficientes para que o número de bactérias duplique, o que significa que um número inicial de 10 bactérias num determinado local em condições favoráveis, se multiplicará de tal modo que se terão aproximadamente 16000000 bactérias ao fim de 8 horas.
  • 4. Proliferação exponencial Esta proliferação exponencial aliada à sua resistência faz com que as bactérias se espalhem muito rapidamente, estando presentes em todos os locais, não só à nosso volta, no meio ambiente, como também no nosso próprio corpo: nas nossas mãos, nariz, boca, tracto gastrointestinal, etc.
  • 5. Artificial x Natural
  • 6. Meios de cultura Até cerca de 1880, os microrganismos eram cultivados em meios líquidos Robert Koch e a sua equipe introduziram os meios de cultura sólidos, os quais permitiram o estudo de espécies isoladas (culturas puras), separando-as de espécies contaminantes. Meios de cultura consistem da associação qualitativa e quantitativa de substâncias que fornecem os nutrientes necessários ao desenvolvimento (cultivo) de microrganismos fora do seu meio natural.
  • 7. Condições favoráveis de crescimento Tendo em vista a ampla diversidade metabólica dos microrganismos, existem vários tipos de meios de cultura para satisfazerem as variadas exigências nutricionais. Além dos nutrientes é preciso fornecer condições ambientais favoráveis ao desenvolvimento dos microrganismos, tais como pH, pressão osmótica, humidade, temperatura, atmosfera (aeróbia, micro aeróbia ou anaeróbia), entre outras...
  • 8. Consistência dos meios Sólidos, quando contêm agentes solidificantes, principalmente ágar (cerca de 1 a 2,0 %); Semi-sólidos, quando a quantidade de ágar ou gelatina é de 0,075 a 0,5 %, obtendo assim uma consistência intermediária, de modo a permitir o crescimento de microrganismos em tensões variadas de oxigênio ou a verificação da motilidade; Líquidos, sem agentes solidificantes, apresentando-se como um caldo, utilizados para activação das culturas, repiques de microrganismos, provas bioquímicas, entre outros.
  • 9. Procedência dos constituintes Podem ser naturais ou complexos:  Ingredientes com composição química não definida, tais como extratos de vegetais (malte, tomate, amido de tubérculos, peptona de soja, etc.), de animais (carne, cérebro, fígado, caseína, etc.) e de microrganismos (levedura); Artificiais, sintéticos ou ainda quimicamente definidos:  Composição química é conhecida (usados para trabalhos de pesquisa) e os seus componentes servem para suprir as exigências nutritivas dos microrganismos, em fontes de carbono, azoto, vitaminas, energia, sais minerais, entre outros, quando são conhecidas as necessidades nutricionais específicas. Meios de cultura básicos  São os que permitem o crescimento bacteriano, sem satisfazer contudo nenhuma exigência em especial; Meios de cultura complexos:  Cumprem com as exigências vitais de determinados microrganismos, como meio de infusão de cérebro e coração, ágar sumo de tomate, ágar sangue, etc.
  • 10. Funções dos meios de cultura Meios de pré-enriquecimento:  Permitem a dessensibilização de microrganismos injuriados, i.e., para amostras que sofreram algum tipo de tratamento (térmico ou químico). Ex. Água peptonada. Meios de enriquecimento:  Proporcionam nutrientes adequados ao crescimento de microrganismos presentes usualmente em baixos números ou de crescimento lento, bem como microrganismos exigentes e fastidiosos. Esses meios têm a propriedade de estimular o crescimento de determinados microrganismos, mas existem alguns que também podem inibir o crescimento de outros. Meios Diferenciais:  Contém substâncias que permitem estabelecer diferenças entre microrganismos muito parecidos, tais como meio de Teague ou Eosina Azul de Metileno (diferencial para coliformes), Ágar MacConkey para a diferenciação de enterobactérias, Ágar sangue, agar Baird-Parker para isolamento e diferenciação de cocos Gram positivos (sólidos).
  • 11. Funções dos meios de cultura Seletivos são os que contém substâncias que inibem o desenvolvimento de determinados grupos de microrganismos, permitindo o crescimento de outros. A maioria deles é também diferencial, permitindo diferenciar as colónias (sólidos) dos microrganismos. Meios de triagem são os meios que avaliam determinadas actividades metabólicas permitindo caracterização e identificação perfunctória ou presuntiva de muitos microrganismos. Identificação, prestam-se para a realização de provas bioquímicas e  verificação de funções fisiológicas de organismos submetidos a identificação. Dosagem, são empregados nas determinações de vitaminas, antibióticos e aminoácidos Contagem, são empregados para a determinação quantitativa da população microbiana. Estocagem ou manutenção são utilizados para conservação de microrganismos no laboratório, i.e., garantem a viabilidade de microrganismos.
  • 12. Meios de proliferação naturais No nosso dia-a-dia convivemos com bactérias, dormimos com bactérias, comemos bactérias, e não conseguimos viver sem elas. Elas estão por todo o lado e reproduzem-se em todo o lado, apenas querem um local com condições propícias. Por isso, há que ter muito cuidado nas nossas casas, pois apresentam-se como os melhores locais para a proliferação das bactérias, tendo em conta que nelas podem encontrar alimento, calor, humidade.
  • 13. Nutrição de microrganismos Nutricionalmente são os mais versáteis e diversificados. Alguns podem viver com poucas substâncias inorgânicas, enquanto outros são tão exigentes quanto o homem. Para caracterizar suas propriedades (morfológicas, fisiológicas e bioquímicas) é necessário o cultivo em laboratório: - Cultivo in vitro: quando se conhece as exigências nutricionais. - Cultivo in vivo: quando exigências nutricionais específicas são desconhecidas. Ex: Mycobacterium leprae (causador da hanseníase) precisa de hospedeiro para ser cultivado.
  • 14. Meios de cultura adequados Para o cultivo laboratorial (in vitro) são utilizados meios de cultura que simulam e até melhoram as condições naturais. Os elementos químicos principais para o crescimento das células são denominados macronutrientes (C, N, H, O, S, P). O carbono é um dos elementos mais importantes para o crescimento microbiano. Com exceção para CO2, os compostos orgânicos são os que contém carbono
  • 15. Macronutrientes: - Necessários em grande quantidade. - Tem papel importante na estrutura e metabolismo.Micronutrientes: - Necessários em quantidades mínimas. - Funções enzimáticas e estruturais das biomoléculas C N H P, S, K, Na ... célula Matéria seca Água
  • 16. Componentes necessários a célula Fonte de carbono: - Compostos orgânicos (microrganismos heterotróficos): carboidratos lipídeos proteínas - Dióxido de carbono (microrganismos autotróficos): É a forma mais oxidada do carbono, assim a fonte de energia deve vir da luz ou compostos inorgânicos. Fonte de Nitrogênio: - É elemento necessário em maior quantidade depois do carbono, cerca de 12 %. (constituinte das proteínas, ácidos nucléicos, etc.) A capacidade de algumas moléculas orgânicas (aminoácidos, peptídeos) bactérias em utilizar o moléculas inorgânicas (NH3, NO3-, N2) nitrogênio atmosférico (FBN) é de fundamental importância para a vida de todos os seres.
  • 17.  Hidrogênio:- Principal elemento dos compostos orgânicos e de diversos inorgânicos. (água, sais e gases) Função: Manutenção do pH Formação de ligações de H entre moléculas Fonte de energia nas reações de oxi-redução na respiração• Oxigênio: - Elemento comum encontrado nas moléculas biológicas (aminoácidos, nucleotídeos, glicerídeos)- É obtido a partir das proteínas e gorduras. Na forma de oxigênio molecular (O2), é requerido por muitos para os processos de geração de energia.
  • 18. Outros macronutrientes:  P – Síntese de ácidos nucléicos, ATP  S – Estabilidade de aminoácidos, componente de vitaminas  K – Atividade de enzimas  Mg – Estabilidade dos ribossomos  Ca – Estabilidade da parede celular e termoestabilidade de endósporos  Na – Requerido em maior quantidade por microrganismos marinhos. Bactérias halofílicas extremas não crescem com menos de 15% de sal.  Fe – Papel-chave na respiração, componente dos citocromos e das proteínas envolvidas no transporte de elétrons.
  • 19. Outros componentes Metais em quantidades muito pequenas (traços) necessários na composição de um meio de cultura: Zn, Cu, Mn, Co, Mo e B► Exercem função estrutural em várias enzimas (ativação) - Nem sempre sua adição é necessária - Meios sintéticos com compostos de alto grau de pureza e água ultra pura podem apresentar deficiências desses elementos.Ex: Mo+6 é necessário para a nitrogenase, a enzima que converte o N2 para NH3 durante a FBN.
  • 20. Água e aditivos Água:- Componente absolutamente indispensável (com exceção dos protozoários que englobam partículas sólidas) No laboratório de utiliza água destilada, filtrada e deionizada.Aditivos: Função de aumentar a conversão, evitar precipitação de íons, controlar a espuma, provocar inibição, estabilizar o pH: Quelantes: na autoclavagem ocorre a precipitação dos fosfatos metálicos EDTA, ácido cítrico, polifosfatos. Inibidores Ex: produção de ácido cítrico por Aspergillus niger Utiliza-se Fosfato e pH < 2 para reprimir o ácido oxálico
  • 21. Outros aditivos Tampões - Carbonato de cálcio - Fosfatos - Proteínas (peptona)Indutores: a maioria das enzimas de interesse comercial precisa de indutores. Ex: celulose induz a celulase pectina induz a pectinase amido induz a amilaseAntiespumantes: cultivos com aeração ocorre a produção de espuma  Remoção de células, perda do produto, contaminação  Redução do volume do meio álcoois, ácidos graxos, silicones, poliglicóis: reduzem a tensão superficial das bolhas
  • 22. Meios de cultura Soluções de nutrientes para promover o crescimento de microrganismos.Não existe um meio de cultura universal, masExistem vários tipos meios para diversas finalidadesPara obter sucesso no cultivo de microrganismos é necessárioo conhecimento de suas exigências nutricionais, para que osnutrientes sejam fornecidos de forma e proporçãoadequada. Quimicamente definidos (sais, compostos orgânicos purificados, água) Classes Complexos (utilizam hidrolisados carne e soja, extratos de levedura, sangue, soro, leite, solo e rúmem de bovino)
  • 23. Meios de cultura
  • 24. Meios quimicamente definidos são utilizados para determinar as necessidades nutricionaisAté 1880 os microrganismos eramcultivados em meios líquidos.Robert Koch introduziu os meiosde cultura sólidos, os quaispermitiram o estudo de espéciesisoladas (culturas puras). Meio de cultura solidificado com 1,5 % de ágar. Controle é um meio mínimo com apenas glicose e sais. 3 isolados bacterianos sendo testados quanto a necessidade de suplementos orgânicos.
  • 25. Meios de cultura Embora não existam meios específicos para todos os microrganismos, existem centenas de formulações para inúmeras finalidades. Alguns são meios gerais: permitem o crescimento de muitas espécies Outros são meios específicos: servem para identificação de espécies, por ex. Escherichia coli e Shigella sonnei em meio MacConkey
  • 26. Microplacas com diferentesmeios de cultura paraidentificação deenterobactérias.
  • 27. Se a bactéria prefere os nutrientes encontrados no sangue, então o sangue é adicionado no meio de cultura. As bactérias podem ser autotróficas ou heterotróficas.Meio definido para quimioautotróficas Meio definido para heterotróficas Meio complexo para heterotróficas
  • 28. Meios de cultura para fungos • Todos os fungos são heterotróficos Geralmente são utilizados meios ricos contendo grande variedade de compostos orgânicos providos pela peptona e extratos de carne ou soja. Também são utilizadas maiores concentrações de açúcares (4%) e pH menor (3,8 a 5,6) do que os meios para bactérias. Essa combinação permite inibir o crescimento de bactérias.
  • 29. Como determinar a composição inicial?Passo 1: utilizar dados da composição elementar Composição elementar média (% do peso seco)Ex: Para produzir 10 g de células bacterianas são necessáriosde 1,3 g (13%) de Nou 7,2 g de (NH4)2SO4 (18% de N) Elemento Bactéria FungoObs: Sais com dois componentes [(NH4)2SO4] podem Carbono 52 51 introduzir o excesso de um deles. hidrogênio 7 7 Nitrogênio 13 8,5Com relação ao carbono considerar também fração para Fósforo 2,5 0,4-4,5energia e manutenção (heterotróficos) Enxofre 0,6 0,1-0,5Fração para biomassa: 1,3 x 4 = 5,2 g de C ou 13 g de Potássio 2,5 0,2-2,5glicose (40% de C) Sódio 0,75 0,02-0,5Fração para energia e manutenção (45%): Cálcio 0,55 0,1-1,4YX/S = 55% 13/0,45 = 28,9 g de glicose Magnésio 0,25 0,1-0,5 Cloro 0,5 -Relação C:N = 28,9/7,2 = 4:1 Ferro 0,1 0,15 Relação C:N média 4:1 6:1e assim por diante. Relação C:N:P:S 85:23:4:1Passo 2: otimização
  • 30. Condições ambientais (fatores abióticos)  Temperatura  Oxigênio  pH  Pressão osmótica, atmosférica, hidrostática  Radiação eletromagnética
  • 31. Temperatura Grupos• Psicrófilos – temperatura ótima abaixo de 15 o C, suscetíveis de crescer a 0 oC.• Mesófilos – temperatura ótima 20o - 40 oC, maioria dos patógenos humanos.• Termófilos – temperatura ótima acima de 45 o C.
  • 32. Efeito do oxigênio no crescimento microbiano Meio gelatinosoDurante as reações de com indicadorredução do O2 são redox:formados vários Rosa quando oxidado Incolor quando reduzidointermediários tóxicos.Ex: H2O2, OH°, O2-Os microrganismosaeróbios e facultativosutilizam enzimas como acatalase para destruir asformas tóxicas Aeróbio Anaeróbio Facultativo Microaerófilo Anaeróbio aerotolerante
  • 33. Sistema para cultivo de anaeróbios
  • 34. Sistema para cultivo de aeróbiosEquipamentos que transferem oxigênio ao meio de cultura
  • 35. pH Ao contrário da temperatura, o pH ótimo para o crescimento encontra-se no valor médio da variação sobre o qual o crescimento acontecerá, Os microrganismos são encontrados em todos os ambientes e portanto em todas as condições de pH. Quando cultivados in vitro, o meio sofrerá alterações à medida que os metabólitos ácidos ou alcalinos são produzidos. Necessário a adição de um tampão ao meio.
  • 36. Pressão osmótica Não devem existir grandes diferenças na concentração de solutos dentro e fora da célula, pois podem desidratar-se ou romper-se.Ex: microrganismos marinhos necessitam de teores de sais mais elevados.