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  • 1. Mapeamento genético em procariotos Prof. Dra. Adriana DantasEngenharia de Bioprocessos e Biotecnologia UERGS – Bento Gonçalves
  • 2. Definições Mapa genético: define a distância entre mutações em termos de freqüência de recombinação Mapa por restrição: Digestão do DNA com enzimas de restrição e medição da distância entre os sítios de quebra Mapa definitivo: conseguido através do seqüenciamento do DNA
  • 3. IntroduçãoNo mapeamento genético, utilizamos conhecimentos de diversas áreas da genética, além de procedimentos estatísticos adequados.Assim, o mapeamento genético envolve a genética mendeliana, a citogenética, a genética molecular, agenética quantitativa (para mapeamento de QTL’s) e a genética de populações.
  • 4. Variação genôomica Fenotípico: função do gene é afetadaPolimorfismo Fragmento de restrição: sítio alvo de enzima é afetado Seqüência: análise direta do DNA• RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism): diferençano mapa de restrição entre dois (ou mais) indivíduos
  • 5. Marcadores moleculares podem ser usados para mapeamento Marcadores são úteis para a construção de mapas de ligação e testes de paternidade. Mapeamento genético: marcadores: RFLPs, SSR, AFLPs, RAPDs, enzimas, proteínas, aminoácidos, etc. genótipo e/ou fenótipo de interesse freqüência de recombinação
  • 6. Teoria Cromossômica da Herança De acordo com a teoria cromossômica... Se os genes R e G estão em cromossomos diferentes: observe os núcleos das células híbridas F1: RrGg
  • 7. Considerações Um indivíduo possui duas cópias de cada partícula de herança (gene). Essas duas cópias são separadas durante a formação dos gametas e juntam-se novamente quando os dois gametas de encontram para formar um zigoto. Um locus (plural=loci) é um local em um cromossomo onde ficam os genes. Os traços são distribuídos independentemente quando os loci dos gene R e G estão em diferentes cromossomos.
  • 8. Genes no mesmo cromossomo Se os genes estiverem no mesmo cromossomo, quando observamos o produto de diferentes meioses, temos os seguintes gametas: RG 50% : rg 50% ; Rg 0% : rG 0b De acordo com Mendel, os traços devem estar distribuídos de maneira independente: RG 25% : rg 25% ; Rg 25% : rG 25% De acordo com a teoria cromossômica, os traços devem estar distribuídos com os cromossomos : RG 50% ; rg 50%
  • 9. Então, qual é o modo de herança real? Na verdade, pode haver um terceiro resultado quando os dois genes estão no mesmo cromossomo. Observa-se também a progênie resultante dos gametas RG e rg em uma maior freqüência do que a progênie dos gametas Rg e rG. RG, rg são gametas do tipo parental (o cromossomo no gameta é o mesmo dos pais) = Rg e rG são gametas não parentais. Como isso acontece? Os gametas não-parentais Rg e rG são formados por meio de um processo chamado de recombinação.
  • 10. Crossing Over e Recombinação Permuta simples
  • 11. Permutas duplas envolvendo 2 cromátides Permutas duplas envolvendo 3 cromátides
  • 12. Permutas duplas envolvendo 4 cromátides
  • 13. Ligação gênica É um dos fenômenos genéticos mais amplamente conhecidos e estudados. Logo após a redescoberta dos trabalhos de Mendel, surgiram relatos de genes que não seguiam a lei de segregação independente. Batenson e Punnett foram os primeiros a relatar o fenômeno em 1905. No entanto, o trabalho mais célebre sobre ligação gênica deve-se a Morgan e seu discípulo Stutervant, em 1911. Estes autores relacionaram os desvios da segregação independente à presença dos genes no mesmo cromossomo e propuseram a utilização da freqüência de recombinação para a realização de mapeamento genético.
  • 14. Proporções na progênie proporção na progênie: 944 : 965 : 206 : 185 Números 944 e 965 são do tipo parental. Números 206 e 185 não são do tipo parental (recombinantes). Se os genes b e vg estiverem em cromossomos diferentes, a proporção 1 : 1 : 1 : 1 poderia ser esperada para os genótipos Se os genes b e vg estiverem nos mesmos cromossomos, a proporção 1 : 1 : 0 : 0 poderia ser esperada para os genótipos
  • 15. Recombinaçao na meiose A recombinação ocorre durante a metáfase da meiose I, (células são 4n, cada cromossomo é duplicado e os cromossomos homólogos são alinhados). Partes de cada cromossomo homólogo realizam o crossing over, trocando, de forma eficaz, o material genético Recombinação (evento de crossing over) ocorre com uma certa freqüência . Os tipos não parentais (recombinantes) são produzidos durante a recombinação. - As células em meiose foram estudadas e observou-se os cromossomos se tocando para formar o quiasma (crossing-over).
  • 16. Seria essa uma evidência de que a recombinação ocorreu? Para provar que houve recombinação, é necessário observar o número de recombinações produzidas. A freqüência da recombinação (FR) é uma medida da probabilidade de troca genética Se os dois genes estão próximos, a freqüência de recombinação é baixa 0% Se dois genes estão distantes, a freqüência de recombinação é alta ~50% Diz-se que os genes estão ligados em um mesmo cromossomo se FR for menor do que 50% Diz-se que os genes não estão ligados se FR for ~ 50%. Eles podem estar bem distantes em um cromossomo ou podem estar em cromossomos diferentes.
  • 17. Frequência de recombinação (FR) calculado
  • 18. Mapas Genéticos Um Mapa de Ligação Genética mostra a ordem dos genes em um cromossomo. A ordem está baseada nos dados de freqüência de recombinação entre os genes Alfred Sturtevant, um aluno no laboratório de T. H. Morgan, usou os dados de freqüência de recombinação para construir mapas de ligação genética. Troca da material genético resultam em gametas “b+” e “vg+” Ele usou valores de FR para atribuir distâncias entre os genes em unidades do mapa (m.u) Exemplo: os genes b e vg em um cromossomo mostram uma freqüência de recombinação de 17% Portanto, o valor FR informa que os genes b e vg estão separados por 17 unidades de mapa no mesmo cromossomo
  • 19.  Sturtevant sabia que a RF entre o gene vg e um outro gene chamado cinnabar (cn) era de 8% Sturtevant descobriu que se os cromossomos fossem entidades lineares, então haveria duas possibilidades: Descobriu que a freqüência de recombinação entre ao genes b e cn era de 9%, assumindo então que o mapa #2 estava correto. Sturtevant compilou todos os dados de ligação e desenvolveu um mapa genético bem mais extenso. Ele inferiu que os genes residiam em cromossomos e conseguiu mapear os genes nos cromossomos observando os dados de FR entre os genes.
  • 20. Recombinação entre dois genes1) Para a recombinação ocorrer entre dois genes ligados deve ocorrer “crossing over“entre eles.2) A probabilidade do “crossing” ocorrer entre dois genes ligados é diretamente proporcional à distância entre eles.3) Então, a freqüência de recombinação pode ser usada como um indicador da distância entre dois genes.
  • 21. Analise de recombinação A análise de recombinação é a técnica usada para determinar quão freqüentemente um “crossing” pode ocorrer entre dois genes durante a meiose e portanto quão distantes esses genes estão um do outro.
  • 22. Para fazer análises de recombinação :1) Um heterozigota para dois genes conhecidos no mesmo cromossomo.2) Um homozigota recessivo para fazer o cruzamento teste (assim cada genótipo terá um fenótipo único).3) Suficiente descendência para cálculos acurados da progenie proveniente ou não de “crossing over”.
  • 23. Mapeamento do cromossomo de E. coli Recombinação entre genes marcadores após transferência A transferência entre um cruzamento é deduzida da existência de recombinantes produzidos pelo cruzamento Antes de ser produzido um gene estável, os genes transferidos devem ser integrados ou incorporados ao genoma receptor por um mecanismo de troca.
  • 24. Troca genética em procariotos Em procariotos não ocorre entre dois genomas inteiros (como ocorre em eucariotos) + a exogenoto + a a- (a) Ocorre entre genoma completo, derivados de F-, a- a+ a- endogenoto chamados endogenoto, e um incompleto, derivado do doador, chamado exogenoto. merozigoto inviável A genetica por recombinaçao em bacterias é a (a)Um único crossing leva a cromossomo a + genetica de merozigotos. linear parcialmente a + (b) diplóide a-(b) Um numero par de a- crossing leva a um anel mais um inviável fragmento linear viável
  • 25. Possibilidades de crossing Um único crossing não é muito útil para gerar recombinantes viáveis, pois o anel é quebrado para produzir um cromossomo estranho, linear, parcialmente diplóide. Para haver o anel intacto, deve haver um numero par de crossing. O fragmento produzido é apenas um genoma parcial, o qual é perdido durante crescimento celular.
  • 26. Gradiente de Transferência Em geral apenas um fragmento do cromossomo doador aparece no receptor Ocorre a quebra espontânea dos pares conjugantes, de modo que o cromossomo inteiro é raramente transferido Isso cria um gradiente de transferência natural, o qual torna menos provável que uma célula receptora receba marcadores genéticos mais finais (marcadores mais longe da origem).
  • 27. Cruzamentos de marcadores doados por Hfr na ordem met, arg, leu •Ocorre muitos fragmento contendo met do que o locus arg, e o locus leu esta met + arg + met + presente apenas num fragmento. met + arg + met + met + arg + met + •Desta forma, quanto mais met + arg + met + próximo o marcador esta de met + arg + met + origem, maior a chance de que ele seja transferido durante a conjugação. met + arg + met +
  • 28. Mapeamento por FR em cruzamentos de bactérias Para obtermos uma resolução alta entre o loci marcador que estão próximos ao gene Usamos a FR para medir essa ligação. Para medir a ligação e obter a distancia de mapa calculada, é necessário que o marcador tenha chance igual de ser transferido junto ao gene.
  • 29. Três marcadores: met, arg, leu •A ordem é met, arg, leu •met é transferidomet+ arg+ met+ primeiro e leu por ultimomet+ arg+ met+ Fragmento transferido de cromossomo Hfrmet+ arg+ met met+ •Porque o ultimo é o leu?met+ arg+ met+ Leu- arg - met - •Porque se selecionamosmet+ arg+ met+ o ultimo, então saberemos que todas asmet+ arg+ met+ Cromossomo F - células que receberam o fragmento contendo esse ultimo marcador também receberá os outros, met e arg.
  • 30. Cálculo da distancia do mapa Unidade do mapa é (u.m) é igual a 1 por cento de crossing no respectivo intervalo. Na pratica isso é calculado, entre o total de recombinantes recuperados, a porcentagem de recombinantes produzidos por crossings entre dois marcadores. Por definição, uma unidade de mapa genético (cM) corresponde a 1% de recombinação. Entretanto, não existe uma relação direta entre cM e número de pares de bases (pb) pois a freqüência de recombinação é influenciada por muitos fatores.
  • 31. Mapeamento cromossômico Mapas em bactérias combina as técnicas de mapeamento de conjugação interrompida, mapeamento de recombinação, transformaçao e transdução. Mapas atuais são utilizados linhagens de Hfr que transferem a partir de pontos diferentes do cromossomo. Em 1963, o mapa de E. coli já detalhava 100 genes, em 1990 mais de 1.400 genes
  • 32. Mapa genetico de 1963 de E. coli
  • 33. Fatores de recombinação Dentre os fatores ambientais, os que mais alteram as taxas de permuta genética são: ‘status’ iônico celular, nutrição, idade e temperatura Em estudos de mapeamento, no entanto, deve-se manter o ambiente o mais homogêneo possível para assegurar a confiabilidade dos dados obtidos. A freqüência de recombinação varia significativamente ao longo dos cromossomos, ocorrendo muito mais recombinação nas regiões medianas dos cromossomos que em regiões estruturais como centrômeros e telômeros. A escolha dos cruzamentos utilizados para mapeamento genético deve ser criteriosa, pois a freqüência de recombinação é extremamente dependente dos genótipos parentais.