Fusão de protoplastos em fungos

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Fusão de protoplastos em fungos

  1. 1. UERGS – Bento GonçalvesGenética de microorganismosProf. Dra. Adriana Dantas
  2. 2.  Dificuldade de cruzamentos intergenéricos ou interespecificos Incompatibilidade que ocorre entre duas linhagens por impedimento de anastomose das hifas Possibilidade de produzir células sem parede celular (protoplasto) e a fusão destas celulas antes incompativeis Cruzamentos entre especies ou generos distintos de fungos
  3. 3. Protoplastos:Protoplastos •células livres de parede celularA ausência da parede: sistema útil •extração de organelas celulares •transferência gênica através da técnica de transformação genética – eletroporação •produção de novos genótipos por hibridação somática
  4. 4.  Em 1957 isolado de leveduras Células esféricas em ambientes osmóticos Totalmente desprovidas de parede celular Enzimas de isolamento: driselase, helicase, zimolase e Novozyn 234  Constituídos por celulases e quitinases Utiliza-se micélio de fungos filamentosos, células de leveduras, conídios germinando ou conídios intactos
  5. 5.  Não deve causar rompimento do protoplasto Estabilizadores osmóticos em meio liquido Sal (KCl, NaCl, MgSO4) Açucar – sacarose Valores de 0,5M a 1M
  6. 6.  Dois processos Substância fusogênicia polietilenoglicol (PEG)  Induzformação de agregados de células e formação de pontes citoplasmática entre elas Eletrofusão  Células expostas a uma fonte de corrente alternada e ficam em linha como um colar de pérolas, em seguida um pulso de corrente continua é dado e há uma quebra reversível da membrana, permitindo a fusão.
  7. 7. Desenvolvimento de produtos de fusão em meio contendo Aneurina (esquerda) ouinositol (direita), utilizando as técnicas de seleção. Protoplastos fundidos foramsemeadas em discos de celofane contendo os suplementos apropriados e incubadosa 25°C por 4 dias.
  8. 8.  Duas formas: Duas linhagens auxotróficas distintas  Em média 105 celulas parentais  Produtos da fusão recuperados em MM Seleção de produtos de fusão com mutantes a agentes inibidores  Cloranfenicol e eritromicina
  9. 9. Linhagem A Linhagem BAuxotrofica a-b- Auxotrofica c-d- Obtenção do protoplasto Fusão (PEG ou eletrofusão)
  10. 10. Recuperação em MM heterocário diploide Seleção para obter diploides (MM)Anaçlise genetica igual ao ciclo parassexual
  11. 11.  Quebras das barreiras de incompatibilidade Interespecíficas:  Aspergillus nidulans x Aspergillus rugulosus  Obtenção de segregantes com cromossomos dos dois fungos Intergenéricas:  Aspergillus x Penicillum; Candida tropicalis x Saccharomyces fibugera; S. cerevisiae x Schizossacharomyces pombe; S lipolytica x Pichia guillemondii
  12. 12. Hibridação somáticaHíbridos nucleares oucitoplasmáticos(cíbridos)•fusõesinterespecíficas , Fusão Perda de um nuclear núcleo•intergenéricas entreparentais sexualmentecompatíveis;•intergenéricos entre Cíbridos Synkarionsparentais sexualmente (Híbridosincompatíveis. citoplasmáticos)
  13. 13.  Organelas celulares são transferidas para estudos de herança citoplasmatica Obtenção de protoplastos anucleados e sua fusão com células nucleadas Restauração da capacidade respiratória por ação de mitocôndrias Biossíntese de produtos do metabolismo secundário Obtenção de cariótipos moleculares Transformação genética Utilizados na separação e análise de cromossomos
  14. 14.  1973 – Neurospora crassa – DNA isolado de linhagens selvagens transferidos para linhagensm deficiente para inositol 1978 – S. cerevisae, protoplastos de mutantes deficientes para leucina (leu-) receberam DNA de celulas de leu+ 1979 – Plasmidio de E. coli carregando genes de levedura
  15. 15.  Células providas de espessa parede celular Fungos filamentosos – micélio – nitrogênio liquido Utiliza-se vetores com plasmidios bacterianos que carregam genes de fungos Para tanto, o DNA é tratado com enzimas de restrição que quebram em pontos específicos e colocam o plasmidio da bacteria E. coli São selecionados e multiplicados na E. coli  Plasmidio E.coli com fragmento contendo gene ga-2 de N. crassa; sintese de triptofano (trpC); arginina (argB); piridoxina (pyr-4); uracila (ura-5) de N.crassa, A. nidulans
  16. 16.  Em estado de competência Conídios intactos ou germinados são tratado com acetato de íitio (0,1M) Excelente estado de competência:  protoplastos na presença de PEG e CaCl2, ou por eletroporação, são altamente receptivos ao DNA exógeno Absorção do DNA  Colocação do DNA junto com os protoplastos é feita com PEG e CaCl2. PEG causa fusão celular com auxilio do CaCl2. DNA total – ação das nucleases é intensa e parte é degradada; proteção usando lipossomos Inibiçãod as nucleases: espermidina, heparina
  17. 17.  Realizar tanto a mutagênese insercional aleatória, como também a mutagênese dirigida. Mutagênese dirigida permite a realização da superexpressão de um ou mais genes, ou também o silenciamento gênico, seja ele parcial ou completo. Técnicas utilizando protoplastos, Agrobacterium tumefaciens e biobalística permitem a superexpressão de um gene tanto por integração heteróloga ou por recombinação homóloga. Técnicas baseadas no RNA são capazes de realizar o silenciamento gênico por meio de regulação pós-transcricional do mRNA. Silenciamento gênico parcial pode ser conseguido com a utilização do RNA antisense e RNA de interferência; já o silenciamento completo é possível utilizando a interrupção do gene em vetores que permitam a recombinação homóloga, via ribozimas e transposons.
  18. 18.  Usado plasmidios de E. coli que contem um ou mais genes empregados no processo de transformação Três destinos:  Uma permuta entre o plasmidio carregando o gene, e o gene no cromossomo do fungo provoca a integração no sitio homologo, ficando então o cromossomo do fungo com o gene mutante e o plasmidio carregando o gene selvagem  O plasmidio é incorporado em um outro local não homologo do cromossomo. O fungo fica com dois genes, um original mutante e outro selvagem  Por uma permuta dupla ou mesmo conversão gênica, o gene do fungo no plasmidio bacteriano substitui o gene mutante no cromossomo do hospedeiro
  19. 19.  Tipo padrão é o pan7-1 Se duplicam independentemente dos cromossomos São instáveis, podendo dar pseudotransformação ou transformação abortiva Seleção é feita na regeneração dos protoplastos que receberam o DNA exógeno
  20. 20.  (A) Atividades biológicas do GFP-tagged variantes de proteína NUDE. Uma cepa (SF2-9) e thenudF7 ts mutante foram transformadas com genes indicados no vetor. Transformantes foram cultivadas por 3 d em meio completo (YAG) sem ou com 0,6 M KCl a 43 ° C, que é uma temperatura restritiva para o mutante nudF7. A cor de conídios na cepa ΔnudE é semelhante ao de cor acastanhada do micélio. A cor de conídios na cepa nudF7 é amarelo. (B) GFP:: NUDE variantes são expressos em níveis semelhantes. Extratos de proteína total foram feitas a partir de uma cepa ΔnudE transformado com genes indicados no vetor . Dois transformantes diferentes foram usados ​para cada GFP:: variante NUDE. Proteínas (12 mg / pista) foram separados em 10% SDS-PAGE e immunoblotted com um anticorpo anti-GFP.

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