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Filogenia molecular

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  • 1. Alinhamentos eárvores filogenéticas:Estudo evolucionáriodos genomas
  • 2. Classificação e nomenclatura biológica Se baseia na idéia de que organismos vivos são divididos em espécies – grupos de organismos similares com um reservatório genético comum Linnaeus – naturalista sueco – classificação em hierarquia: Reino, Filo, Classe, Ordem, Familia, Gênero e Espécie Identificação de espécie – binômio Gênero e Espécie ex. Homo sapiens
  • 3. Linha Evolutiva do HomemLINHA EVOLUTIVA DO HOMEMORDEM PRIMATASSUB-ORDEM ANTROPOIDES PRÓ-SÍMIOSGRUPO CATARRINOS PLATIRRINOSSUPERFAMÍLIA HOMINOIDES Hilobatídeos Pongídeos Panídeos HominídeosFAMÍLIA (orangotangos) (homens) (Gibões) (Gorilas, chimpanzés)
  • 4. Evolução Física Postura ereta Liberação dosMembros superiores Manipulação de objetos Alterações físicas Evolução cerebral Mudanças Desenvolvimento Evolução Cultural comportamentais Social (saber do (saber erudito) fazer)
  • 5. Forças evolutivas MUDANÇAS CLIMÁTICAS FORTE PRESSÃO SELETIVA ASSIM: POSTURA ERETA E BIPEDALISMOFORAM SELECIONADOS FAVORAVELMENTE
  • 6. Mecanismos de evolução Principal força de evolução
  • 7. Duplicação dos genes Susumu Ohno, 1970, Evolution by gene duplication. Berlin, SpringerVerlag
  • 8. Hipótese de Ohno “Gene duplication emerged as the major force of evolution. Only when a redundant gene locus is created by duplication is it permitted to accumulate forbidden mutations and emerge as a new gene locus with unknown function”
  • 9. Duplicação gênica • Duplicação em tandem • Translocação • Transposição • Não disjunção meiótica • Poliploidia
  • 10. Mutações não silenciosasMutações específicas levam a novas funções gênicas: Sítio ativo de enzimas ou de ligantes de proteínas; Elementos reguladores determinam expressão espaço-temporal dos genes duplicados.
  • 11. Evolução do tamanho e Composição de genomas Variedade em tamanho e organização do genoma:  Bactéria marinha Brevundimonas diminuta – 1,6 Mb  Eucariotos: Neoceratodus forsteri – mais de 50Gb [1 gigabase (Gb) = 109 pb] Variação na composição nucleotidea:  Bacteria = GC – de 20 a 70%
  • 12. Complexidade organísmica e o paradoxo do valor C Amoeba dubia – 670 Gb  200 x maior que o genoma humano  Menos complexa que o ser humano • evolução, desenvolvimento ou comportamento Se refere ao paradoxo do valor C  quantidade característica de DNA por célula de um organismo Eucariotos com genomas grandes não tem mais genes do que os que tem genomas pequenos.
  • 13. Consistência genômica DNA extra  Sequencias repetitivas  Elementos transponíveis  Introns mais longos e sequencias não codificadoras intercalam os genes Aumento do tamanho do genomas resultou do numero efetivo da população, diminuia efeciencia da seleção para eliminar as duplicações gênicas e as inserções de elementos transponiveis
  • 14. Modelo do paradoxo C´O aumento do tamanho do genoma, não foi em si próprio adaptativo, mas o DNA extra propiciou muitas oportunidades novas para a origem de inovações genéticas mediante especialização da função de genes duplicados, evolução de sequencias reguladoras em grandes íntrons, e assim por diante´
  • 15. Composição de bases doDNA genômico Ampla variação do conteudo G+C entre organismos éa viés mutacional (Suoeka, 1988) Significa mudança preferencial de GC para AT, ou vice-versa
  • 16. Viés mutacional Viés mutacional pró-GC empurrará gradualmente o genoma em direção a um conteudo de G+C mais alto Viés mutacional pró-AT levará a um conteÚdo G+C mais baixo. Em regiões codificadoras, a extensão dessas mudanças é restringida pela natureza do código genético, pois alguns aminoácidos necessitam de códons ricos em A+T, e outros ricos em G+C. A terceira posição de muitos códons é mais flexível e as diferentes composições de bases entre organismos estão em geral refletidas em diferenças no conteúdo G+C da terceira posição do códon, o que é simbolizado por GC3
  • 17. Conversão gênica enviesada Sequencias semelhantes de DNA interagem no processo de recombinação Fitas de DNA de uma pequena região da dupla-hélice se separam e formam pares de base com uma das fitas de outra dupla hélice no mesmo núcleo. Pareamento se faz com parte correspondente da molécula de DNA que constitui o gene homólogo Nessa região pareadas, as vezes há mau pareamento, são corrigidos pelo reparo de mau pareamento, o nucleotídeo malpareado é removido e substituído por um nucleotídeo correto (aleatório) Na conversão gênica enviesada há preferência pelo par G-C ou A-T
  • 18. DIFERENÇAS ENTRE ESPÉCIES Divergência sinônima e não-sinônima Duas sequencias coficadoras alinhadas, por exemplo, sequencias de diferentes espécies, é considerar sítio por sítio, levando em conta todas as substituições nucleotídeas possíveis em cada sitio seriam sinônimas e não sinônimas Esses sítios não são fixos, mudam ao longo do tempo  oportunidades mutacionais
  • 19. Fungos mutualistas x patogênicosGenômica estruturalContribuição para o entendimento das relações fungo-planta do ponto de vista evolutivo, o fato de que um microrganismo endofítico pode se tornar patogênico.O que faz um fungo ser patogênico?A capacidade de causar doenças se origina de multiplas vezes durante a evolução.
  • 20. Analise genômica comparativa: evoluçãoda fitopagenecidade
  • 21. Comparações genômicas permitem Apontar novas famílias de genes que podem ter função de virulência, permitindo sua seleção para estudos funcionais Identificar mecanismos patogenicos conservados e inovações e adaptações patogênicas de linhagens especificas Revelar onde eventos de transferência gênica horizontal contribuíram para aquisição de novas funções associadas a virulência
  • 22. EvoluçãoMolecularO estudo da históriados organismosatravés dasmacromoléculas...
  • 23. Evolução Alteração das freqüências gênicas
  • 24. Inferências filogenéticaspodem ser feitas através de: • Caracteres Morfológicos • Aspectos comportamentais • Fisiologia • Moléculas
  • 25. Os organismos possuem padrões
  • 26. E as moléculas tambémAlinhamento múltiplo de proteínas ribossomais L36
  • 27. Uso da filogenia  Historia da biogeografia  Estudar onde os organismos vivem em seus nichos  Estudar a similaridade entre os organismos
  • 28. Árvore filogenética• Diagrama constituído de nós e ramos, na qual um ramoconecta dois nós adjacentes, representando relações deancestralidade.•Representa a história evolutiva de um grupo de espécies oupopulações (árvore de espécie).•Árvore construída apenas com um gene par cada espécie –não representa a história evolutiva da espécie, mas sim dogene (árvore gênica)
  • 29. Alouatta Ateles raiz Lagothrix nó Grupos monofiléticos nó Ancestral de Lagothrix e Brachyteles Brachyteles Tempo evolucionárioNó representa um unidade taxonômica (OTU), que pode ser umaespécie atual ou ancestralRamo representa a relação entre táxons em termos de descendência eancestralidadeComprimento do ramo representa o número de mudanças queocorreram ao longo do ramo desde sua separação do ancestral comummais recente ea raiz, ancestral comum a todos os taxons.
  • 30. Filogenia comcaracterísticasmorfológicas Source: Cardini, A. 2003. The geometry of the Marmot (Rodentia: Sciuridae) mandible: phylogeny and patterns of morphological evolution. Systematic Biology, 52(2): 186-205.
  • 31. Filogenia geográficaSource: Ribas, C.C. and Miyaki, C.Y. 2004. Molecular systematics in Aratinga parakeets: species limits and historical biogeography in the ‘solstitialis’ group, and the systematic position of Nandayus nenday. Molecular Phylogenetics and Evolution, 30: 663-675.
  • 32.  Até ~1990, as filogenias eram baseadas na morfologia da especie Agora temos muitas sequencias de DNA e dados genomicos disponiveis que podemos ter filogenia baseada na molecular e morfologica.
  • 33. Como é feita a analise filogenética? Inicia-se com um simples sequencia de 6 nucleotídeos a partir de 5 especies: A ACGTAA B CCTTAA C CGTCAA D CGTCCG E CGTCCGObserve um único carácter
  • 34. Posição 1: especie A tem um A onde todos tem um CPosição 3: especie A tem um G onde todos tem um TPosição 2: especie A e B tem um C onde todos tem um G Continua com outras muitas posições A ACGTAA B CCTTAA C CGTCAA D CGTCCG E CGTCCG
  • 35. Análise filogenética Dois principais métodos:  Métodos baseados em distâncias  Métodos baseados em caracteres
  • 36. Árvores...
  • 37. Árvores Filogenéticas A OTU – Unidade Taxonômica Operacional F (Nó terminal) B G Ramo TerminalI H C Nó ancestral D Ramo Ancestral E
  • 38. Árvores Filogenéticas A 2 A F 3 B B 1 G 2 2 CI H C 2 1 D 6 D E E 1 unidade Tempo
  • 39. Árvores Filogenéticas C A A D F B GI C R H B D E E Te m p o
  • 40. Relógio Molecular  À medida que duasespécies divergem de um ancestral comum,acumulam mutações emuma taxa regular, ficando progressivamente maisdiferentes uma da outra...
  • 41. Relógio Molecular A A1 A2 Especiação 1 mutação 2 mutações 2 mutações 1 mutação2 mutações 3 mutações Acúmulo de Diferenças
  • 42. Homologia Um caráter é homólogo em dois organismos se foi herdado por ambos a partir de seu ancestral comum. Para análise de sequências:  Não existe percentagem de homologia: ou uma seqüência é homóloga, ou não é  Quanto maior a similaridade entre as seqüências, maior a probabilidade de serem homólogas  No entanto, duas seqüências podem ser homólogas e não apresentar similaridades
  • 43. HomologiaExemplos:Órgãos homólogos – asas de morcego e mãos de humanos (mesma origem)Órgãos similares – asas de morcego e asas de borboleta (mesma função)
  • 44. HOMOLOGIA vs SIMILARIDADEEstes conceitos tendem a ser extremamente confundidos quandoaplicados a sequências de DNA e proteínasAplicações comuns: ‘high homology’, ‘significant homology’, ‘35%homology’.O termo homologia se refere a uma descendência evolucionária comum,enquanto similaridade se refere a uma medida quantitativa daquilo que háem comum.
  • 45. Definições Críticas Concluir que duas (ou mais) sequências são homólogas é uma suposição/ hipótese Só é possível se pudermos explorar diretamente os ancestrais comuns e todas as suas formas intermediáriasHomologia entre dois genes → Similaridade entre eles (variável observávelque pode ser expressa numericamente e correlacionada com probabilidade)
  • 46. Homólogos: Ortólogos e ParálogosImportante !!! Distinguir entre dois tipos de relação entre homólogos, asquais diferem em suas implicações evolutivas e funcionais.Ortólogos: genes presentes em diferentes Especiaçãoorganismos que se originaram de umancestral comum antes da especiação Duplicação do geneParálogos: genes presentes em um mesmoorganismo (geralmente famílias multigênicas)que evoluíram dentro de um mesmo genoma(antes ou depois da especiação)
  • 47. Duplicação Gênica Aumento da quantidade de genes nas células Freqüente formação de pseudo-genes  (genes que foram desligados)
  • 48. Vantagens e Desvantagens Vantagens: • A comparação entre organismos muito diferentes é possível • Uso de genes diferentes para diferentes problemas • A evolução molecular é melhor compreendida que a morfológica • Existem modelos e testes • Relógio molecular e Neutralismo - Teoricamente é possível datar os eventos de divergência.
  • 49. Vantagens e Desvantagens Desvantagens:  Técnicas mais caras  Uso de produtos cancerígenos e radioativos  Árvores de genes e não de espécies
  • 50. Escolha do Gene De acordo com a taxa de substituições nucleotídicas, levando em conta o tempo estimado de divergência dos organismos a serem comparados  Pseudogenes, regiões intergênicas e íntrons são indicados para espécies próximas ou populações  Histonas são indicadas para filogenias entre reinos.
  • 51. Métodos Moleculares Extração do DNA total do organismo Reação de PCR com “primers” apropriados para amplificar o gene escolhido Purificação dos fragmentos Seqüenciamento
  • 52. Métodos Moleculares Verificação da qualidade dos cromatogramas
  • 53. Análise das Seqüências BLAST (ferramenta do NCBI)  Permite a comparação rápida da seqüência obtida no laboratório com as seqüências presentes nos bancos de dados  Permite a busca por seqüências semelhantes para a construção de filogenias
  • 54. Análise das Seqüências  Alinhamento de bases  Garante que os sítios a serem comparados tenham maiorAAC T T probabilidade de seremThomólogosAA C AGT C AT T GGT GT C C T T GT AGT TAAC T T C AGT GAT T GGAGT C C T C T GT AGGT AC GAAT T T C AGT C AT NGGT GT C C T C T GT AGT AACAAC T T C AGAC AT T GGT GT C C T T T GT AGT T AC
  • 55. Métodos de Reconstrução da Filogenia Métodos que buscam, dentre todas as árvores possíveis, a que melhor represente a história evolutiva dos organismos estudados:  Máxima Parcimônia • Escolha da topologia que apresentar o menor número de substituições.  Máxima Verossimilhança • Escolha da topologia que apresentar o maior grau de adequação a um modelo de substituição.  Evolução Mínima • Escolha da topologia que apresentar o menor tamanho dos ramos • Problema: O número de topologias aumenta exponencialmente com o número de OTUs.
  • 56. N. de OTUs N. de árvores N. de árvores não enraizadas enraizadas2 1 13 3 14 15 35 105 156 945 1057 10.395 9458 135.135 1.3959 2.027.025 135.13510 34.459.425 2.027.02515 2,13458 x 1014 7,90585 x 101220 8,20079 x 1021 2,21643 x 102025 1,19257 x 1030 2,53738 x 102830 4,9518 x 1038 8,68736 x 103640 1,00985 x 1057 1,31149 x 105550 2,75292 x 1076 2,83806 x 1074
  • 57. CARACTERÍSTICAS DE UMA ÁRVORE FILOGENÉTICAA maioria das árvores apresenta um padrão mais complexo →necessidade de outros termos Seqs. monofiléticas: derivam de um ancestral comum Clade: grupo de seq. monofiléticas Grupo parafilético: quando algumas seqs. da clade são excluídas Grupo Polifilético: seqs. derivadas de diferentes ancstrais Árvore Inferida ≠ Árvore Real
  • 58. Alinhamento de Sequências Diferenças entre sequências são pontuadasSe forem homólogas → ancestral comum = base para o estudoOs métodos utilizados SEMPRE produzem uma árvore, mesmo cominformações errôneasOs nucleotídeos homólogos devem ser comparados
  • 59. Conversão do alinhamento em uma árvore Diversos métodosMATRIZ DE DISTÂNCIASTabela contendo as distâncias evolucionárias entre todos os pares desequências.Distância evolucionária: n° diferença de nucleotídeos = comprimento do ramo comprimento das sequências
  • 60. Conversão do alinhamento em uma árvore NEIGHBOR-JOINING- Usa os dados da matriz de distâncias- Inicialmente, assume que há só um nó interno e todos os ramos que levam às seqs. de DNA se irradiam dele.- Um par de seqs. é escolhido ao acaso, removido do nó e anexado a um novo nó- O comprimento do ramo é calculado- Este processo é repetido com todos os possíveis pares até a identificação do ramo com o menor comprimento- As sequências restantes passam pelos mesmos passos descritos acima até que o ramo com o segundo menor comprimento seja identificado, e assim sussecivamente
  • 61. Conversão do alinhamento em uma árvore MÁXIMA PARSIMÔNIAUsa os dados de alinhamento mútiploParsimônia: é a preferência pela explicação mais simples para umaobservaçãoEstratégia que analisa diferentes árvores, identificando aquela queapresenta a menor via evolucionária = aquela que requer o menor númerode mudanças de nucleotídeos para ir da seq. ancestral até as maisrecentesÁrvores são construídas ao acaso e o número de mudanças nucleotídicas écalculado até todas as possíveis topologias terem sido examinadas.
  • 62. Métodos baseados em distâncias• A matriz de caracteres é transformada em uma matriz de distâncias• UGMA ( agrupamento de pares não ponderados baseado na média aritmética)• Quadrado mínimos (LS, least squares)• Evolução mínima (ME, minimum evolution)• Agrupamento de vizinho (NJ, neighborjoining)
  • 63.  Método dá máxima parcimônia (MP) O princípio de parcimônia é um princípio filosófico largamente empregado na Ciência. Foi proposto por um filósofo inglês, Ockam no século XVII e seu enunciado é aproximadamente o seguinte: S “Se existe mais de uma explicação para uma dada observação, devemos adotar aquela mais simples.” O método de máxima parcimônia foi empregado em análises de seqüências moleculares com o propósito de reconstrução de árvores filogenéticas (Eck e Dayhoff , 1967).
  • 64. Método dá máxima parcimônia (MP)•É baseado na suposição de que a árvore mais provávelé a que requer o menor número de mudanças paraexplicar toda a variação observada na matriz decaracteres (ex. seqüencias alinhadas).• Baseia-se no principio da homologia, ou seja, se doistáxons compartilham uma característica é porque foiherdado do ultimo ancestral comum a ambos.
  • 65. O princípio da parcimônia nas reconstruções filogenéticas•A aplicação do princípio de máxima parcimônia nasreconstruções filogenéticas é conceitualmente muitosimples: •Devemos escolher, dentre as árvores possíveis, aquela com o menor número de substituições que seja compatível com as seqüências observadas. •Entretanto, a implementação é complexa, pois o número de árvores possíveis pode atingir valores muito altos.•
  • 66. Para 3 seq üências, existe apenas um a árvore possível (que sejam bifurcantes, árvores tais com o A--B--C n ão são consid erad as):Para 4 seq üências, existem 3 árvores (bifurcantes) possíveis.
  • 67. Para 5 seqüências existem 15 árvores (bifurcantes):
  • 68. Avaliação da acurácia da árvore reconstruída ANÁLISE BOOTSTRAPConstrução de um novo alinhamentoao acaso:O novo alinhamento compreende sequênciasque são diferentes do verdadeiroMas tem um padrão similar de variabilidade
  • 69. Quantas árvores?•O número de árvores cresce muito rapidamente à medida queaumenta o número de seqüências.•Para 10 seqüências,mais de um milhão de árvores são possíveis.Para se atingir o número de partículas elementares do Universoconhecido (~ 1080), bastam 59 seqüências! E isso contando apenas asárvores sem raiz e estritamente bifurcantes.

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