Culturas puras e microorganismos através do microscópio
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  • Here is photograph of colonies growing on SBA. This is the vaccine strain of Bacillus anthracis , but non-vaccine strains look substantially similar. You can see the flat, wavy-edged, ground-glass appearing colonies.

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  • 1. Prof. Dra. Adriana Cibele de Mesquita Dantas UERGS – Bento Gonçalves
  • 2. Introdução Os microorganismos sào pequenos demais a serem vistos a olho nu Para tanto, utiliza-se um microscópio Alguns microorganismos são mais visíveis que outros, devido ao tamanho ou a características mais facilmente observáveis Procedimentos de coloraçao na parede celular, membranas e outras estruturas
  • 3. Unidades de medidas  Unidades de microorganismos:  micrometro (µm) = 0,000001m  Micro indica dividida por 1 milhão (10-6)  Nanômetro (nm) = 0,000000001 (10-9)
  • 4. Anton van Leeuwenhoeck (1632 - 1723)Ao segurar seu microscopio proximo a fonte de luz, conseguiu observar organismos vivos que eram muito pequenos a serem visto a olho nuA amostra foi colocada na exremidade de um ponto ajustavel e visualizada do outro lado atraves de uma lente minuscula, quase esférica.Maior ampliaçao possivel com esse microscopio foi de 300x
  • 5. Louis Pasteur (1822 - 1895)• Inexistência da geração espontânea• Teoria microbiana das doenças• Fermentação, decomposição de alimentos• Pasteurização• Descrição de bactérias associadas às doenças (Staphylococcus, Streptococcus)• Vacina anti-rábica
  • 6. Robert Koch (1843 - 1910)•Estudo do antraz - Postulados de Koch•Técnicas para obtenção de culturas puras•Placas de Petri•Técnicas de coloração•Estudos com Mycobacterium tuberculosis•Descrição de Vibrio cholerae,Trypanosoma•1905 - Prêmio Nobel de Medicina
  • 7. Processamento dos espécimes• Adequação da amostra - sítio de coleta, quantidade e qualidade• Coleta - Sem contaminação• Transporte - Acondicionamento, Identificação• Inoculação em meios de cultura - Enriquecimento, Seletivos ou Diferenciais• Isolamento do patógeno - Semeadura por esgotamento, com incubação a 35ºC, em aerobiose ou anaerobiose• Exame inicial após 24 horas• Análise macroscópica do crescimento• Análise microscópica• Caracterização do microrganismo - análises bioquímicas, sorológicas, moleculares• Análise do perfil de resistência a antimicrobianos
  • 8. Culturas puras Distribuição uniforme de bactérias é essencial para visualização das colônias Método mais comum; semeadura por esgotamento Com alça de inoculação estéril mergulhada na cultura mista, posteriormente cultivada em meio solido Isoladas com alça obtém-se culturas puras, contendo somente um tipo de bactérias.
  • 9. Obtenção de culturas puras Origem de uma colonia visivel a partir de um único esporo, de uma celula vegetativa ou de um grupo de microorganismos em grumos ou cadeias Apresentam caracteristicas morfologicas diferentes, que permitem diferenciar as colonias
  • 10. Incubação em condições de anaerobiose  Com o contato com oxigênio pode causar morte das bactérias anaeróbicas  Crescimento com meio cultivo especiais denominados meios redutores  Tioglicolato de sódio, combina-se com o oxigênio do meio e elimina da cultura
  • 11. Quantificar diretamente o crescimentomicrobiano Determinar numero de células  No. Cels/ml em meio liquido ou gr em material solido Determinar a massa total populacional  Formulas matematicas, ex.:  70 cels = 10-6 mL  X cels = 1 mL  Utiliza-se procedimentos de diluições
  • 12. Contagem em placa Técnica mais utilizada na determinação da população bacteriana Somente as células viáveis são contadas Esperar 24 horas para células visíveis Somente em culturas puras, de uma única bactéria A contagem em placas são chamadas Unidades formadoras de colônias, unidades são os grumos ou cadeias das bactérias
  • 13. Diluição em série 10 mil bactérias / mL 1 mL mostrará 10 mil colônias em placa – difícil de contar Transfere-se 1 mL para um tubo de 9 mL de caldo de cultura = 1000 bactérias / mL Transfere-se 1 mL = 100 bactérias / mL Transfere-se 1 mL – 10 bactérias
  • 14. Metodo de pour plate Inoculo = 1,0 mL ou 0,1 mL da diluição bacteriana colocada diretamente na placa de petri Adiciona-se inoculo em placa sem meio e após o agar, mistura-se suavemente Crescimento das colônias na superfície como dentro do meio
  • 15. Espalhamento na placa Adição de inoculo em placa 0,1 mL contendo meio solido Espalhamento por uma alça Crescimento na superfície do meio
  • 16. Contagem direta no microscópio Volume conhecido de suspensào é delimitada em uma área definida em um lâmina ‘Petroff-Hausser’ Contadores eletronicos de celulas = contadores Coulter
  • 17. Análise microscópicaColoração de Gram
  • 18. Coloração álcool-ácido resistente Se liga apenas a bactérias que possuem material céreo em suas paredes . Identificação do gênero Mycobacterium: M. tuberculosis, M. leprae e linhagens patogênicas de Nocardia. O corante carbolfucsina é aplicado aum esfregaço fixado e a lâmina é aquecida por vários minutos A seguir a lâmina es esfriada, secada e lavada com água. O esfregaço é tratado com o descolorante álcool –ácido (remove o colorante vermelho das bactérias que nâo são álcool-ácido (al-ác) resistêntes. Os microorganismos al-ác resistêntes retêm a cor vermelha pois a carbolfucsina é mais solúvel nos lipídeos da parede celular que no al-ác.
  • 19. Coloração de Ziehl-Nielsen
  • 20. Outras técnicas de coloração: Coloração Negativa(presença de cápsula), coloração de flagelos, coloração de endósporos.  Coloração Negativa: Permite demonstrar a presencia de Negativa cápsula (revestimento gelatinoso). Mistura-se as bactérias com tinta nanquim ou nigrosina para criar um fundo escuro e cora-se as bactérias com coloração simples com safranina.  Coloração de Endósporos (Técnica de Schaeffer-Fulton): Utiliza-se verde malaquita para a coloração primaria. A safranina utiliza-se como contracorante para corar as poções da cálula que não os endósporos.
  • 21. Outras técnicas de coloração: Coloração Negativa(presença de cápsula), coloração de flagelos.Colorante: Nigrosina Colorante: Carbolfucsina:Aumentar diâmetro dos falgelos.
  • 22. Difusão em ágar –Método de Kirby &Bauer
  • 23. Microdiluições: Em placas Elisa
  • 24. “ELISA” (do inglês “Enzyme Linked ImmunonoSorbent Assay) Se baseia reações antígeno-anticorpo detectáveis através de reações enzimáticas. A enzima mais comumente utilizada nestas provas é a peroxidase, que catalisa a reação de desdobramento da água oxigenada (H2O2 ) em H2O mais O2 . Existem vários modelos de testes de ELISA; Forma mais simples, chamada ELISA indireto, um antígeno aderido a um suporte sólido (placa de ELISA) é preparado; a seguir coloca-se sobre este os soros em teste ( ex. soro humano), na busca de anticorpos contra o antígeno. Se houver anticorpos no soro em teste ocorrerá a formação da ligação antígeno-anticorpo, que posteriormente é detectada pela adição de um segundo anticorpo dirigido contra imunoglobulinas da espécie onde se busca detectar os anticorpos (humana, no caso), a qual é ligada à peroxidase.
  • 25.  Outro método é o chamado ELISA de bloqueio ou competição, em que apresença de anticorpos em determinado soro é revelada pela competição com um anticorpo específico (mono ou policlonal) dirigido contra o antígeno. Igualmente, o resultado é dado pela adição de um conjugado, porém a coloração aparecerá nos orifícios onde não havia anticorpos.
  • 26. Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima - ELISA O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois conjugados com enzimas. Fosfatase alcalina Peroxidase B-galactosidase O produto final corado surge por ação da enzima que converte um substrato incolor em um produto colorido (ou o substrato alterado pela enzima induz mudança de cor de uma substância indicadora). A quantidade de Ag ou Ac produto final corado, através de leitura em fotocolorímetro. Principais tipos de ELISA: indireto, sanduíche, competição e captura.
  • 27. TIPOS DE ELISA: Direto e Indireto INDIRETO DIRETO OU PLACA SANDUÍCHE UTILIZADA
  • 28. ELISA IndiretoELISA Direto ou Sanduíche
  • 29. ELISA Competitivo Aplicações do ELISA:  Testes de rotina em Laboratórios Clínicos e de Pesquisa Vantagens: Teste de alta sensibilidade Permite quantificar Ag ou Ac das amostras Seguros e de baixo custo
  • 30. AFINIDADE DE INTERAÇÃO • Força da interação entre um único epitopo antigênico e um único sítio de combinação com o antígeno Alta afinidade Baixa Afinidade Ab Ab Ag Ag Afinidade = Forças de atração e de repulsão KA[Ag] + [Ac ] ⇔ [Ag-Ac] KA= ConstanteKA= [Ag-Ac] ÷ ([Ag] + [Ac]) intrínseca de associação
  • 31. Reatividade Cruzada • Quando os antígenos são estruturalmenterelacionados podendo ocorrer a reatividade de um anticorpo com outro epitopo antigênico. Reações CruzadasAnti-A Anti-A Anti-A Ab Ab Ab Ag A Ag B Ag C Epitopo compartilhado Epitopo similar
  • 32. FORÇAS QUE ATUAM NAS INTERAÇÕES ANTÍGENO/ANTICORPO Moléculas que apresentam grupos laterais iônicos de cargas opostas que se atraem fortalecendo a interação Ag-Ac. Forças fracas que ocorrem devido à proximidade física entre as moléculas. A mais fraca das ligações. Ocorrem entre o núcleo de um átomo e a nuvem de elétrons de outro formando dipolos que se atraem. Atua em moléculas não polares facilitando a aproximação, os choques moleculares e as ligações.
  • 33. Avidez• São as forças totais de interação entre um antígeno com o anticorpoKeq = 104 106 1010 Afinidade Avidez Avidez
  • 34. RESPOSTA DE ANTICORPOS EspecificidadeHabilidade do Ac distinguir seu imunógeno de outros Ag. QuantidadeN° de células B x taxa de síntese do Ac x persistência após suaprodução. IsotipoDetermina a persistência (meia vida in vivo diferente).A composição determina a função dos Ac e os locais onde sãoencontrados. AfinidadeForça de ligação do Ag com o Ac, em um único sítio. Quanto maior aafinidade entre Ac e Ag, menos Ac será necessário. Avidez: força total de ligação, nos dois sítios.
  • 35. INTERAÇÕES Reações reversíveis. reversíveis Ligações não covalentes:-Pontes de hidrogênio-Interações hidrofóbicas-Interações de Van der Waals-Ligações iônicas
  • 36. MÉTODOS 1) Reagentes não marcados • Reação de precipitação • Reação de aglutinação 2) Reagentes marcados • RIA • ELISA • Imunofluorescência • Western Blotting
  • 37. MÉTODOS APLICAÇÕES PRECIPITAÇÃO- Imunodifusão dupla- Imunodifusão radial - Pesquisa- Imunoeletroforese - Diagnóstico AGLUTINAÇÃO -- Aglutinação direta e indireta Soroepidemiologi- Inibição da aglutinação a- Teste de Coombs IMUNOENSAIOS- RIA- ELISA- Imunofluorescência e Citometria de Fluxo- Western Blotting
  • 38. PRECIPITAÇÃO X AGLUTINAÇÃO Precipitação:Formação de complexos Ag/Ac. Aglutinação:É o agrupamento de partículas, usualmente por moléculas de Acque se ligam a Ag na superfície de partículas adjacentes. As reações de precipitação e de aglutinação decorrem,respectivamente da ligação entre o Ac e Ag solúvel eparticulado.
  • 39. REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO Interação entre Ac e Ag solúvel Ac precisa ser bivalente Ag precisa ser bi ou polivalente A reação pode ser afetada pelo n° de sítios de ligação que cada Ac possui para seu Ag VALÊNCIA PRECIPITAD O
  • 40. É importante levar-se em conta como ocorre a ligação Ag-Ac em diferentes concentrações dos mesmos. Observe abaixo:Anticorpo livre + - -Antígeno livre - - + 100%-- Percentual de complexo imune precipitado Zona de excesso Zona de Zona de excesso de anticorpo equivalência de antígeno Quantidade de antígeno adicionado
  • 41. TÉCNICAS DE PRECIPITAÇÃO EM GEL IMUNODIFUSÃO Imunodifusão Dupla: • Coloca-se agarose sobre uma lâmina: • Faz-se em seguida, pequenos orifícios no gel e são adicionadas as soluções testes de Ag e Ac, como por exemplo, é mostrado abaixo: Ac
  • 42. IMUNODIFUSÃO DUPLA As soluções sofrem difusão e, quando o Ag e o Ac se encontram em zona de equivalência, se observa a reação pela formação de uma linha de precipitação: Pode ser visualizada pós lavagem do gel , para remoção das proteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitação com corante Utilização: muito usada em pesquisa e diagnóstico de algumas Ag Ag doenças, como cisticercose Ac Ag Ag Ag Ag Ac Ac 46
  • 43. IMUNODIFUSÃO RADIAL Permite a quantificação do antígeno ou do anticorpo. O processo continua até ser atingida a zona de equivalência, com os complexos precipitando- se em um anel (halo) em torno do orifício. Utilização: dosagem Poços onde são de IgG, IgA e IgM e colocados proteínas séricas. padrões e amostras a Agarose serem dosados contendo anticorpos Halo de anti-IgG IgG – precipitação anti-IgG humana
  • 44. IMUNOELETROFORESE Pode-se fazer comparação de misturas complexas de Ag que são separados em gel de agarose, pela aplicação de uma corrente elétrica. As moléculas migram para o pólo negativo, distribuindo-se no gel de acordo com os seus PM e cargas elétricas. Uma canaleta é recortada entre os poços e preenchida com Ac, que se difunde. Ag e Ac formam arcos de precipitação. 1- Separação de antígenos 2- Anti-soro na coluna canaleta Ag canaleta + - Ag 3- Difusão e precipitação 48
  • 45. REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO Ac + Ag multivalente particulado Título: maior diluição que ainda causa aglutinação (semi- quantitativo) Pó-zona: excesso de Ac Potencial Zeta: alguns Ag podem apresentar carga elétrica (repulsão) Agregação visível departículas = Eritrócitos,bactérias, fungos e látex
  • 46. AGLUTINAÇÃO DIRETACélulas ou partículas insolúveis + Ac = Aglutinação Exemplo: tipagem sanguínea em lâminas (sistema ABO) 1) Amostra de sangue na placa teste: 2) Reagente (anticorpo anti A, B): 50
  • 47. AGLUTINAÇÃO DIRETA 4) Mistura-se: 3) Controle negativo: 51
  • 48. AGLUTINAÇÃO DIRETA5) Leitura do resultado: negativo positivo Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação visível (aglomeração dos eritrócitos na placa teste), como ilustrado acima. 52
  • 49. AGLUTINAÇÃO INDIRETA (PASSIVA)Ag solúveis associados a outras superfícies(Partículas de látex ou superfície de hemácias)Exemplo: Hemaglutinação Passiva para aDoença de Chagas:• As hemácias são revestidas com Ag do T. cruzi(ligação covalente) e então distribuídas nos poçosda placa.• O soro teste e os controles positivos e negativos,devidamente diluídos, são adicionados aos poços da referida placa.• Se houver Ac específico contra o Ag, ashemácias se aglutinam e formam uma camadano fundo do poço. Quando não existe Ac específico,as células formam um botão no Aglutinação fundo do poço. Positiva Negativa
  • 50. INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃOExemplo: presença de hCG na urina (gravidez) + Resultado Urina negativo: Soro anti - hCG (ausência de hCG Partículas Adicionam-se na urina). revestidas com hCG Ocorre aglutinação, São incubados e colocados pois os anticorpos numa placa anti-hCG não são bloqueados na incubação inicial, porque não havia o Resultado positivo: hormônio na urina. (presença de hCG na urina): não ocorre Livres, podem aglutinação. aglutinar as partículas Ac se ligaram no hCG da urina, revestidas de hCG. (ficando bloqueados), na incubação inicial 55
  • 51. IMUNOENSAIOS Reagentes marcados (enzimas, fluorocromos, isótopos) Tipos:- RIA- ELISA- IFA / CITOMETRIA DE FLUXO- WESTERN BLOTTING
  • 52. IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA) Princípio da técnica:  Anticorpos ou antígenos são conjugados (ligados de modo covalente) a uma substância (fluorocromo), que, quando excitada por radiações UV, emite luz no espectro visível.  Assim, como a ligação Ag-Ac é específica, um anticorpo conjugado pode ser usado para detectar um determinado antígeno e vice-versa.  A reação é feita em lâminas de microscopia (um pouco mais finas que as comuns) e a observação tem lugar num microcópio com luz UV (microscópio de fluorescência).  Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína – FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina – TRICT). Tipos: direta, indireta ou saduíche.
  • 53. Microscópio de fluorescência com epiluminação fluorescência emitida luz UV atinge o ma- chega ao observador terial examinado
  • 54. TIPOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA
  • 55. APLICAÇÃO DA TÉCNICAIFA direta: Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes, em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais.IFA indireta: Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como a Doença de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenças auto-imunes. É uma técnica onde se consegue alta sensibilidade (fluorescência é mais intensa) e especificidade.
  • 56. IMAGENS
  • 57. CITOMETRIA DE FLUXO Ferramenta que detecta e quantifica células individuais passando em uma corrente através de um feixe de Laser. Separa as células por fluorescência ativada. Cada anticorpo pode ser marcado com um fluorocromo diferente. É um teste qualitativo e quantitativo.APLICAÇÕES Tipo de linfócitos; Quantidade, tamanho, granulosidade; Isolamento de populações celulares; HIV
  • 58. RADIOIMUNOENSAIO - RIA Marcações:  I125: emite raios gama  H3: raios beta Reprodutibilidade, especificidade e sensibilidade (em torno de 10-12g) Desvantagem a manipulação de isótopo radioativo. Aplicações: Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue, Hormônios, proteínas séricas, drogas, vitaminas e Ac. Pesquisa
  • 59. Metodologias que utilizam reagentes não marcados:•Precipitação•Aglutinação•Hemólise (Fixação de Complemento)Metodologias que utilizam reagentes marcados•Radioimunoensaios•ELISA•Imunofluorescência•Western Blotting•Citometria de Fluxo
  • 60. Zona de equivalência: Ag-Ac se ligam equimolarmente formando uma rede estável. Excesso de antígeno: Os complexos podem ser dissolvidos quando há excesso de Ag pois o Ac fica livre para se ligar a novos Ag adicionados diminuindo a formação de complexos insolúveis. Excesso de Ac: Ocorre redução de imunocomplexos pois todo o Ag está precipitado e fica Ac livre no sobrenadante.Pró-Zona
  • 61. Imunodifusão radial (Mancini) Ac no gel • Método – Anticorpo no gel Ag Ag Ag Ag – Antígeno no poço  Interpretação  Diâmetro do anel é Diameter2 proporcional à concentração do Ag  Quantitativo  Níveis de Ig Ag Concentração
  • 62. Imunoeletroforese/Precipitação• Método – Antígenos são separados por eletroforese – Anticorpo é colocado num corte no ágar + - Ag Ag Ab Ag Ab• Interpretação – Arco de precipitina representa a interação Ag-AC
  • 63. Imunoeletroforese/Precipi tação
  • 64. WESTERN BLOTTING Eletroforese de proteínas. Identifica antígenos ou anticorpos.
  • 65. WESTERN BLOTTING
  • 66. WESTERN BLOTTING
  • 67. Caracterização sorológica
  • 68. Atividadesdesempenhadaspelo MicrobiologistaClínico
  • 69. Processamento dos espécimesAdequação da amostra - sítio de coleta, quantidade e qualidadeColeta - Sem contaminaçãoTransporte - Acondicionamento, IdentificaçãoInoculação em meios de cultura - Enriquecimento, Seletivos ou DiferenciaisIsolamento do patógeno - Semeadura por esgotamento, com incubação a 35ºC, em aerobiose ou anaerobioseExame inicial após 24 horasAnálise macroscópica do crescimentoAnálise microscópicaCaracterização do microrganismo - análises bioquímicas, sorológicas, molecularesAnálise do perfil de resistência a antimicrobianos
  • 70. Semeadura por esgotamentoMeios ricos, seletivos, diferenciais
  • 71. Incubação em condições de anaerobiose
  • 72. Análise macroscópica do crescimento
  • 73. Análise microscópicaColoração de Gram
  • 74. Coloração de Ziehl-Nielsen
  • 75. Outras técnicas de coloração
  • 76. Caracterização bioquímica
  • 77. Caracterização bioquímica
  • 78. Difusão em ágar -Kirby & Bauer
  • 79. Macrodiluições
  • 80. Microdiluições
  • 81. ELISA
  • 82. Western blot
  • 83. Análises moleculares PCR Geometric Amplification 20 ↓ 1st cycle 21 2 cycle ↓ nd 22 ↓ n th cycle ↓ 2n
  • 84. ELISA
  • 85. Western blot
  • 86. Análises moleculares PCR Geometric Amplification 20 ↓ 1 cycle st 21 ↓ 2 cycle nd 22 ↓ n th cycle ↓ 2n
  • 87. Enxergando os microrganismos:Microscópio  Ampliação: jogo de lentes, campo magnético  Resolução: depende do comprimento de onda utilizado para enxergar Há dois tipos: Óptico: Fase, campo escuro, fluorescência Jogo de lentes (20-2000x) Luz visível (300-700nm) Eletrônico: Transmissão, varredura Campo magnético (até 40000x) Feixe de elétrons
  • 88. Figura microscópio
  • 89. Figura resolução www.bmb.psu.edu/courses/ micro107/microscopy/
  • 90. Esterilização de meios e equipamentos Escolha entre esterilizar (morte de microrganismos vegetativos e esporos)  UV  Vapor úmido (mínimo 20 minutos – 120 °C )  Vapor seco (acima de 150 °C )  O aumento da temperatura e do tempo aumenta a perda de nutrientes (vitaminas)  Melhor aumentar a temperatura e diminuir o tempo (UHT) Pasteurização (morte de patogênicos)  62 °C em 30 minutos, resfriamento brando Tindalização (70-100 °C ) 1 h, após 24 h repete Desinfecção (desinfetantes, antissépticos) Agentes quimioterápicos (Sulfa, Cloranfenicol, antibióticos) Filtro de lã de vidro