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Conjugação e transdução
 

Conjugação e transdução

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    Conjugação e transdução Conjugação e transdução Presentation Transcript

    • Conjugação e Transdução em bactérias Prof. Dra. Adriana Dantas UERGS - Bento Gonçalves
    • RE PRODUÇ ÃO• Reproduç ão A s s exuada Divis ão celular / Fis s ão Binária - A mitos e - Duplicaç ão do DNA - S eparação da c élula mãe em duas c éls -filhas S epto de divis ão
    • RE PRODUÇ ÃO• Reproduç ão S exuada C onjugação Trans ferência de plas mídios por pontes citoplas máticas Trans dução Introdução de fragmentos de DNA entre bactérias Bacteriófagos Trans formaç ão A bs orção de fragmentos de DNA de bactérias lis adas no meio
    • C LA S S IFIC A Ç ÃO Pos itivas • C orante de G ram C hris tian G ram - 1884 Negativas  MetodologiaC orante Violeta iodo (fixação) metanol (des coloração) S afranina Paede Cel a + espessa r ul r G ram Pos itivas F m o 1 º cor nt ixa ae A ou V et zul iol a Conta e r st Paede Cel a - espessa r ul r G ram Negativas Descol a s or da F m o 2° cor nt ixa ae V mel er ho
    • C LA S S IFIC A Ç ÃO• B actérias G ram-pos itivasVárias es pécies de:  E s treptococos ; E s tafilococos ; E nterococos• B actérias G ram-negativas  Vibrião colérico; C los tridium; s almonelas goulart@ucg.br
    • GE NÉ TIC A B A C TE RIA NA• Genomar aiv ment pequeno el t a e Compaa a G r do o enomaE r o ucaiot• Cont t dir o com o cit a ao et opl sma Pr r os – A ê de caiot ocaiot us ncia r eca• Compost pordifer modaida de DNA o entes l des -Cromossomo -Pl smídeo a -Ta r nsposon -Ba eró go ct i fa
    • C ROMOS S OMO• F adupl /Cir a it a cul r• Difuso nar ã nucl ó egi o e ide• T ma v r de a do com o gr a nho aia cor upo < Mycop lasm a genitalium (580 Kb ) Paa ax V l r r sit ida iv e > Myxococcus xanthus (920 Kb) 0• G paao met bol e cicl v l enes r a ismo o ita it í• Const udo porpat codifica es res nt A ê de Introns e R õ Int gê s us ncia egi es er nica• Const uem Rep licons it Unida mol aes ca zes de r ç o a ô des ecul r pa eplica ã ut noma
    • PLA S MÍDE O• M é ade DNAcir a ol cul cul r• T ma v rá el a nho ai v 1.0 0x /10 0 x cr 0 .0 0 omossomo ba er no ct ia• M ior da ba éia ta ta1 ou + t a ia s ct r s r nspor ipos• G “a óios” enes cess r Nã essencia àsobr iv nciada ba éia o is ev ê s ct r s R ê àa ibióicos, pr ç o de t s, ... odu ã oxina Sel ç o Naur l eã t a esist ncia nt t A pt bil de em condiç es especia da a ida õ is• A idos pel Conj ç o dquir a uga ã R oduç o sexua epr ã da Ta ê porpont cit a áica r nsfer ncia es opl sm t s
    • TRA NS POS ON• Fr gment de DNAl rde t ma v rá el a os inea a nho ai v í Mnimo 5 Kb• Codificapr ena a óia ot í s cess r s E er oxina enzima degr daiv s nt ot s, s a ta• Eement mó eis l os v Ca zes de inser em no cr pa ir omossomo ba er no ct ia• Ta ç o r nsposi ã A ó ainser ã deixa có s no st e se desl m damol cul ps ço m pia í io iga é a• IS– Seqü ncia de inser ã ê s ço Responsá elpel pr v o ocesso de t a ç o r nsposi ã Seqü ncia especifica de DNA(~10 0pb ) ê s s 0 CodificaTa r nsposase
    • B A C TE RIÓFA GO• DNAde or v a igem ir l• Inser ã do DNAv a no cr ço ir l omossomo ba er no ct ia• Vr ba eró gos ta t m genes que codifica faor de v ul ncia áios ct i fa r nspora m t es ir ê oxina éica Coryneb acterium d ip htheriae – t dift r Clostrid ium b otulinum – t bot í oxina ulnica Escherichia coli – cit oxina ot• Conv sã de ba éia nã paogê s em paogê s er o ct r s o t nica t nica A ó infecç o porba eró gos ps ã ct i fa
    • Variabilidade Embora as mutações sejam responsáveis pela expressão de várias novas características por uma célula, muitos dos fenótipos expressos pelos microrganismos procarióticos são decorrentes da aquisição de novos fragmentos de DNA, por meio de processos de transferência horizontal de genes.
    • Processos de Transferências  Transformação  Conjugação  Transdução.  Conversão lisogênica
    • Transformação É definida como um processo de incorporação de DNA na forma livre, geralmente decorrente da lise celular. A partir de seu descobrimento, foi demonstrado formalmente que o DNA era a molécula envolvida na hereditariedade (F. Griffith, 1928). Várias bactérias Gram positivas e negativas são naturalmente transformáveis, entretanto, dentro de um gênero, nem todas as espécies o são.
    • Reprodução Bacteriana Transformação Reprodução sexuada A transferência de material genético ocorre quando uma célula receptora capta DNA solúvel liberado no meio por células doadoras.
    • Transformação natural Processo de incorporação de DNA exógeno na forma livre, geralmente decorrente da lise celular ou extraídos de células doadoras. Para que ocorra transformação a célula deve ser competente, isto é, deve apresentar sítios de superfície para a ligação do DNA da célula doadora e apresentar a membrana em uma condição que permita a passagem deste DNA. Envolve a participação de diferentes proteínas (proteína de ligação ao DNA, presente na membrana, autolisinas, nucleases), sendo um processo variável entre os microrganismos (nem todos apresentam competência). Exemplos de bactérias naturalmente competentes: Bacillus, Streptococcus, Neisseria
    • Célula transformada (recombinante)
    • Processo de Transformaçao Na natureza, o processo ocorre quando uma célula sofre lise, liberando seu DNA. Este, por ser de grande tamanho tende a sofrer quebras, originando centenas fragmentos de aproximadamente 15 kb (o equivalente a cerca de 15 genes, em Bacillus subtilis). Como uma célula absorve poucos fragmentos, apenas uma pequena proporção de genes podem ser transferidos. Inicialmente, para que o processo ocorra, é necessário que a cél. encontre-se competente, isto é, deve apresentar sítios de superfície para a ligação do DNA da célula doadora e apresentar a membrana em uma condição que permita a passagem deste DNA.
    • Competência celular Aparentemente, o número de sítios disponíveis para a ligação do DNA é limitado. Esta captação parece estar relacionada a uma pequena sequência, de 10 a 12 pares de bases, presente no DNA exógeno. Em Haemophilus, foi demostrada a presença de uma proteína que reconhece e liga-se a uma sequência 5’ - AAGTGGGTCA - 3’, muito comum no genoma deste microrganismo, garantindo que somente ocorrerá a captação de DNA de espécies muito similares. A competência é um processo que depende de várias condições distintas nos diferentes microrganismos. Sabe- se que a fase de crescimento e as condições ambientais desempenham um papel de extrema importância no processo. Além destes, a temperatura e a concentração de cátions também influenciam a eficiência do processo.
    • Captaçao do DNA A captação do DNA também é diferente entre Gram positivos (G+) e Gram negativos (G-): Nas G+ o DNA é captado como dupla hélice e absorvido como fita simples, sendo uma das fitas degradadas. Nas G-, o DNA é absorvido como fita dupla, embora apenas uma das fitas participe do processo de recombinação. Independente do tipo celular, a ligação do DNA à célula é mais eficiente quando está como fita dupla.
    • Ligação do DNA As células competentes ligam o DNA com muito mais eficiência que células não competentes (1000 vezes mais). Streptococcus pneumoniae é capaz de ligar apenas cerca de 10 moléculas de DNA de dupla fita, de 15 a 20 kb. Quando são absorvidas, como DNA de fita simples, estas passam para cerca de 8 kb. Em Haemophilus influenzae, é necessário que o DNA tenha uma sequência específica de 11 pb, para que haja a ligação irreversível e o DNA seja captado.
    • Integração do DNA: O DNA liga-se a proteínas na superfície celular, sendo em seguida absorvido ou tendo uma de suas fitas degradadas por nucleases antes da absorção. À medida que o DNA é absorvido no interior da célula, este se associa a proteínas de ligação ao DNA de fita simples, protegendo-o de degradação. A proteína RecA também participa deste processo, associando-se à fita e promovendo a recombinação. Há então a degradação do que resta da fita simples e formação de um DNA híbrido, que na replicação originará uma molécula parental e outra recombinante.
    • Transformação emStreptococcus, umorganismo Gram positivo.O autoindutor (1) aoencontrar o receptor (2)interage com este,promovendo a ativação devários genes (3, 4 e 5) dentreeles as autolisinas,nucleases e proteína deligação ao DNA.Uma das fitas do DNA passaa ser captada pela célula,enquanto a outra édegradada (6).Ao penetrar na célula a fitasimples é protegida porproteínas. Caso este DNaencontre uma regiãocomplementar, a proteínaRecA auxiliará suarecombinação com o DNAendógeno (7).
    • Conjugação Processo de transferência de DNA de uma bactéria para outra, envolvendo o contato entre as duas células (Tatum & Lederberg, 1946). A conjugação está associada à presença de plasmídeos de natureza F. Estes plasmídeos contêm genes que permitem a transferência do DNA plasmidial de uma célula para outra ou, em outras palavras, a capacidade conjugativa. Quando a célula porta um plasmídeo de natureza F é denominada F+, doadora, ou macho, enquanto células desprovidas de tais plasmídeos são denominadas F-, receptoras, ou fêmeas.
    • Reprodução Bacteriana Conjugação Reprodução sexuada É um processo de transferência de material genético, promovido por plasmídios conjugativos.
    • Conjugação Transferência de genes através do contato entre células bacterianas. O DNA é transferido diretamente de uma bactéria para outra. 2 tipos de células envolvidas na conjugação: Doadora: possui plasmidio F (fertilidade) denominada célula F+ Receptora: não possui plasmídio F, denominada célula F-
    • Células Hfr (high frequency of recombination) são células onde oplasmídio F torna-se integrado ao cromossoma. Possuem maiorcapacidade conjugativa ou de transferência.
    • Transferência do plasmídio F de uma célula doadora (F+) para célula receptora (F-)
    • O cruzamento entre célula Hfr x F- resulta na transferência defragmentos de DNA cromossomal de uma célula para outra.Raramente ocorre transferência completa dos genes do plasmídio Fentão a célula receptora continua F- porém incorpora genes da céluladoadora em seu genoma (recombinação)
    •  A capacidade conjugativa está associada à presença de determinados genes localizados em um operon denominado tra. Estes genes conferem uma série de características envolvidas na conjugação tais como a síntese do pilus F, responsável pelo reconhecimento e contato entre as células, assim como a transferência do DNA plasmidial. Eventualmente, os plasmídeos podem ser integrados no cromossomo, sendo este processo mediado por pequenas seqüências de DNA denominadas IS (insertion sequences). As células apresentados tais plasmídeos integrados são denominadas Hfr (do inglês High Frequency of Recombination). Quando integrados, esses plasmídeos podem mobilizar a transferência de genes cromossomais também.
    • Conjugaçao em gram negativas Dois tipos: – entre células F+ e F-, resultando em duas células F+ – entre células Hfr e F-, resultando em uma célula Hfr e outra F-. Nos dois processos, acredita-se que o mecanismo provável de transferência do DNA seja pelo círculo rolante, onde apenas uma das fitas é transferida, sendo a fita complementar sintetizada pela célula receptora. O estímulo para o disparo do processo seja o contato das células. Assim, a conjugação envolve a passagem de DNA de uma célula F+ para outra F-, que torna-se então F+ também. Nestes casos, passam grandes blocos de DNA da célula Hfr para a receptora, promovendo extensas recombinações.
    • Transdução bacteriana Transferência de informação genética mediada por um bacteriófago Transferência mediada por vírus, podendo ser generalizada (qualquer fragmento de DNA) ou especializada (determinados genes, passados por fagos temperados).
    • Reprodução Bacteriana Transdução Reprodução sexuada É a transferência dos genes cromossômicos ou de moléculas de plasmídios de uma bactéria para outra, por meio de um bacterófago.
    • Bacteriófago Um fago (também chamado bacteriófago) é um pequeno vírus que infecta apenas bactérias. Da mesma forma que vírus que infectam eucariontes, os fagos consistem numa proteína exterior protetora e no material genético (dupla hélice em 95% dos fagos conhecidos) dentro da cápsula de 5-650 Kbp (1 Kpb = 1.000 pares de bases). Os fagos foram descobertos independentemente por Frederick Twort em 1915 e por Félix D’Herelle em 1917.
    • Fagos Fagos infectam especificamente bactérias. Alguns fagos são virulentos, significando que uma vez que a célula tenha sido invadida, eles imediatamente iniciam seu processo de reprodução, e em pouco tempo "lisam" (destroem) a célula, lançando novos fagos. Alguns fagos (bem conhecidos como fagos temperados) podem ao contrário entrar em um estado relativamente inofensivo, e então integrar seu material genético no DNA cromossomal da bactéria hospedeira (muito semelhantes aos retrovírus endógenos em animais) ou estabelecendo- se a si mesmos como plasmídeos.
    •  Estes fagos endógenos, referidos como profagos, são então copiados a cada divisão celular junto com o DNA da bactéria hospedeira. Eles não matam a célula, porém monitoram (via algumas proteínas que eles codificam para isto) o estado de seu hospedeiro. Quando a célula do hospedeiro mostra sinais de stress (significando que ela esteja próxima de sua morte), os fagos endógenos tornam-se ativos novamente e iniciam seu ciclo reprodutivo, resultando na lise de célula hospedeira. Um exemplo é o fago lambda da E. coli. Algumas vezes, mesmo profagos podem prover benefícios para as células hospedeiras enquando dormentes, pela adição de novas funções ao genoma da bactéria, um fenômeno chamado conversão lisogênica.
    • Importância na biologia molecular Utilizados como vetores de clonagem para inserir DNA bas bactérias. Eles estão sendo também avaliados por pesquisadores médicos como uma alternativa aos antibióticos para tratar infecções por bactérias (porque matar bactérias é o que os fagos fazem de melhor). Phage display é um teste para investivar interações de proteínas pela integração de múltiplos genes de um banco de genes em fagos.
    • Transdução generalizada Descoberta em Salmonella typhimurium com o fago P22, embora este processo também ocorra em outras bactérias, tais como E. coli. Este tipo de processo requer a ocorrência de um ciclo lítico, onde eventualmente pode haver o empacotamento de fragmentos de DNA da célula hospedeira, gerando partículas denominadas partículas transdutoras, que correspondem ao capsídeo viral contendo em seu interior DNA bacteriano. Embora não possam ser descritas como vírus, as partículas transdutoras exibem a capacidade de adsorção à superfície de outras células bacterianas. A frequência com que um determinado gene é transferido é baixa uma vez que cada partícula transdutora leva apenas um determinado fragmento de DNA (1 em 106 ou 108 cél. recebem um determinado gene).
    • Transdução generalizada: durante um ciclo lítico, pode haver a incorporação de DNAbacteriano no capsídeo viral. Este DNA poderá ser transferido para outra bactéria, pois osprocessos de adsorção e injeção de DNA dependem da estrutura do vírus, independentedo tipo de DNA contido em seu interior .
    • Transdução especializada: Evento raro, embora bastante eficiente. O exemplo melhor conhecido e primeiramente descoberto foi a transferência de um genes que codificam produtos envolvidos na degradação de galactose pelo fago l de E. coli. A etapa inicial no processo corresponde à infecção e lisogenização do fago, que ocorre em sítios específicos do genoma. Neste caso, a integração do fago ocorre adjacente ao conjunto de genes envolvidos na utilização de galactose.
    • Transdução especializada Pela ação de algum indutor (ex: UV) há a separação do fago do genoma (integração reversa), que normalmente ocorre perfeitamente. Entretanto, em alguns casos, essa separação é defeituosa, promovendo a remoção de genes bacterianos e deixando parte do genoma viral na célula. Essas partículas podem ser de dois tipos: – aquelas que carregam genes gal – outras que carregam genes bio. Aquelas partículas levando genes gal são denominadas ldgal (defectivas, contendo o gene gal), porque são incapazes de formar partículas virais maduras (porque deixam no hospedeiro o gene que codifica a proteína integrase).
    • Transdução especializada: este processo é dependente da ocorrência de um ciclolisogênico. O fago integra seu DNA ao DNA bacteriano e após um determinado período detempo e de acordo com certos estímulos, este fago pode iniciar um ciclo lítico. Caso a excisãodo DNA viral ocorra de maneira defeituosa, poderá haver a transferência de um pequenofragmento de DNA bacteriano (porque parte do DNA viral ficará incorporado ao genomabacteriano). Este vírus "defeituoso" poderá transferir o DNA bacteriano para outras células.
    • Conversão lisogênica: Transferência de genes de fagos para bactérias. A própria lisogenização torna a bactéria imune a outras infecções por este fago, mas além disso, outros fenótipos podem ser adquiridos. O exemplo mais clássico consiste na conversão de células atoxigênicas de Corynebacterium diphtheriae em toxigênicas, pelo fago ß. Assim, a bactéria recebe um gene que codifica uma toxina, sendo este gene de origem viral.
    • Biologia do Bacteriofago Um dos vetores mais utilizados nos processos de clonagem molecular é o denominado bacteriófago λ, o qual comporta-se como um vírus da E.coli. O fago λ é um parasita obrigatório da E.coli, o qual necessariamente deve injetar o seu DNA na bactéria hospedeira para a sua multiplicação.
    • Infecção da E .coli o genoma do fago pode seguir duas vias: a) Estado lítico, o DNA do fago permanece na bactéria como uma molécula independente, havendo a ativação de alguns genes do fago e a concomitante inativação de outros, dentro de um programa estritamente definido. Como resultado o cromossomo do fago é replicado ativamente, ocorre a síntese das proteínas da capa e da cauda, formam-se novas partículas virais. Em aproximadamente 45 minutos após a infecção a célula hospedeira é lisada havendo a liberação de cerca de 100 novos fagos.
    • Infecção da E .coli o genoma do fago pode seguir duas vias: b) Estado lisogênico: Neste caso, o DNA do fago é integrado no cromossomo da bactéria passando a ser chamado profago. No estado lisogênico, todos os genes do profago estão inativos com excessão do gene que produz a proteína repressora. A bactéria hospedeira carregando o profago multiplica-se e este é replicado passivamente e distribuído para as bactérias descendentes.
    •  Em condições naturais a opção entre seguir o estado lítico ou lisogênico depende das condições do meio. Assim, via de regra em meio rico em nutrientes o estado lítico é preferencial, por exemplo o fago λ na bactéria E.coli intestinal. Por outro lado, em meio pobre de nutrientes como é o caso da E.coli no solo, o fago prefere o estado lisogênico. Em condições experimentais, o estado a ser seguido depende de um balanço entre os fatores do meio intra e extra celular e de fatores genéticos da bactéria hospedeira e do bacteriófago
    • Genoma do fago λ O bacteriófago lλ é uma partícula viral constituída de aproximadamente 50% de proteínas e 50% de DNA. O DNA do fago λ, na forma como ele é isolado da partícula viral, é uma molécula linear com dupla fita de aproximadamente 48.500 pares de bases. As extremidades da molécula contém uma fração de DNA fita simples com cerca de 12 nucleotídeos, os quais são complementares na sequência de bases e através delas é que o DNA assume a forma circular quando ele é injetado na célula hospedeira. Estas extremidades são denominadas de sítio cos. O genoma do fago λ codifica para aproximadamente 50 proteínas, cujos genes tem um cronograma de expressão bem definido, o que determina a instalação do estado lítico ou lisogênico.