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  • 1. Forschungsberichte – Technologie
  • 2. Kurzdarstellung Kansas State University Untersuchung Biologische Reduktion auf Oberflächen durch Fotokatalyse und Ozon Zusammenfassung: Am Institut für Lebensmittelwissenschaft, Fachbereichs Fleischtechnologie, der Kansas State University in Manhattan Kansas wurden die Untersuchungen unter der Leitung von Dr. James Marsden, anerkannter Professor für Fleischtechnologie (Regent’s Distinguished Professor), durchgeführt. Kansas State ist eine der führenden Universitäten Amerikas auf dem Gebiet der Fleischtechnologie und Dr. Marsden ist weltweit als einer der Spitzenforscher und führenden Experten im Bereich Lebensmittelsicherheit bekannt. Zehn der gefährlichsten Formen von Hefen, Schimmelpilzen, Bakterien und Viren wurden einer neuen und innovativen fotokatalytischen Reaktion, der Radiant Catalytic Ionization ( AktivePure) unterzogen. Diese zehn Organismen wurden innerhalb einer Testkammer auf einen Edelstahlträger gebracht und die ActivePure‐Zelle wurde für 24 Stunden eingeschaltet. Testergebnisse wiesen nach 24 Stunden eine Reduzierung von 96,4 % bis 100 % auf. Diese Untersuchung bestätigt die Wirksamkeit und die Geschwindigkeit, mit der RCI Oberflächen in Innenbereichen unter Verwendung eines natürlichen und sicheren Oxidationsprozesses behandelt. Diskussion: Die Mehrzahl der Luftverunreinigungen entsteht auf Oberflächen. Aus diesem Grund müssen alle Versuche, biologische Kontaminationen in Innenräumen unter Kontrolle zu halten, besonders die Oberflächen betreffen. Mikroorganismen wie Schimmel, Bakterien und Viren gedeihen besonders gut auf feuchten Oberflächen. Daher konzentriert sich die Lebensmittelindustrie darauf, pathogene Stoffe in allen Bereichen, die mit Lebensmitteln in Kontakt kommen, unter Kontrolle zu halten und zu beseitigen. Dr. Marsden forscht vor allem mit dem Ziel der Verbesserung der Lebensmittelsicherheit und strebt ein besseres Verständnis und die Kontrolle mikrobiologischer Kontamination an. In letzter Zeit konzentriert sich die Forschung von Dr. Marsden auf die Verwendung fortschrittlicher Fotokatalyse, eine Technologie, die Oxidationsmittel entwickelt, die aktiv pathogene Keime, die sich in der Luft und auf Oberflächen befinden, reduzieren. Zehn Mikroorganismen wurden für die Analyse ausgewählt. Drei Proben jedes Mikroorganismus wurden vorbereitet und auf einen Edelstahlobjektträger gegeben. Die Proben wurden jeweils nach 2, 6 und 24 Stunden Verweildauer analysiert. Folgende Testorganismen wurden verwendet: • Staph (Staphylococcus aureus) • MRSA (Methycillin restistenter Staphylococcus aureus) • E‐coli (Escherichia coli) • Anthrax Familie (Bacillus spp.) • Strep (Streptococcus spp.) • Pseudomonas aureuginos • Listeria monocytogenes • Candida albicans • Schwarzer Schimmel (Stachybotrys chartarum)
  • 3. • Vogelgrippevirus H5N8 Diese Organismen wurden der Luft ausgesetzt, die durch einen fotokatalytischen Reaktor, RCI (ActivePure) zirkuliert. Mehrere Parameter wurden überwacht, darunter die Temperatur und die Feuchtigkeit. Die UV‐Lampe in der fotokatalytischen Zelle wurde in der Zuluft‐Leitung angebracht, um UVGI‐Nebeneffekte durch die Lampe auszuschließen. Da Ozon eines der in diesem fotokatalytischen Prozess produzierten Oxidationsmittel ist und da bekannt ist, dass es gesundheitliche Bedenken bei einem zu hohen Ozongehalt gibt, wurde der Ozongehalt genau beobachtet und sichergestellt, dass ein Gehalt von 20 Teilen pro Milliarde eingehalten wird. Damit wird die von der EPA [US Umweltschutzbehörde] festgelegte Höchstgrenze für dauernden Kontakt deutlich unterschritten. Zusätzlich zur Testkammer, in der ActivePure und der Korona‐Ozonentladungsgenerator eingesetzt wurden, wurde eine Kontrollkammer eingerichtet, um den natürlichen Abbau der Testorganismen zu untersuchen. Da einige biologische pathogene Keime von allein absterben, wenn sie mit Luft in Berührung kommen, muss jede seriöse Untersuchung auch diese Art der Reduzierung berücksichtigen. Die Testergebnisse des Berichts beziehen sich immer auf die Reduzierung lebensfähiger Organismen bezüglich der Kontrollprobe. Die Testergebnisse waren verblüffend. Nach 24 Stunden Betriebsdauer hatte sich die Lebensfähigkeit der neun Organismen um 96,4 % bis zu 100 % verringert. Hier ist anzumerken, dass die Doppelblindstudie den natürlichen Abbau untersucht. Die Schnelligkeit, mit der ActivePure die pathogenen Keime reduzierte, überraschte die Forscher ganz besonders. Nach 2 Stunden Betriebszeit betrug die Reduzierung durchschnittlich über 80 %. Nach 6 Stunden Betriebszeit betrug die Reduzierung durchschnittlich über 90 %.
  • 4. Auswirkungen der ActivePure (RCI) Technologie Reduzierung gewöhnlicher Bakterien und Pilze auf Oberflächen* (24‐Stunden‐Test) Durchschnitt aus zwei 24‐Stunden‐Tests (Prozent der mikrobiologischen Reduzierung)
  • 5. Vergleich der Auswirkungen ActivePure (RCI) Technologie mit der Ozon‐ Technologie Reduzierung gewöhnlicher Bakterien und Pilze auf Oberflächen * (24‐Stunden‐Test) Durchschnitt aus zwei 24‐Stunden‐Tests (Prozent der mikrobiologischen Reduzierung) RCI Technologie Ozon (O3) Untersuchung durchgeführt durch die Kansas State University Ergebnisse der Feldforschung können aufgrund von Umgebungsbedingungen variieren *Anhand von wissenschaftlichen Untersuchungen wurde demonstriert, dass die Verwendung von Luftreinigern von ActivTek den mikrobiologischen Befall auf Oberflächen * deutlich reduziert. Dies gilt sowohl für Escherichia coli, als auch für Listeria monocytogenes, Streptococcus spp. Pseudomonas aeruginosa, Bacillus spp. Staphylococcus aureus, Candida albicans und S. chartarum. Derzeit erhebt ActivTek keinen Anspruch auf ähnliche Ergebnisse für Mikroorganismen in der Luft. Diese Ergebnisse wurden bislang noch nicht von der FDA [US Arzneimittelzulassungsbehörde] bewertet. Diese Produkte dienen nicht Diagnose, Behandlung, Heilung oder Prävention von Krankheiten. ActivTek (Technologien für gesunde Umwelt)
  • 6. Die Wirksamkeit der Radiant Catalytic Ionization (ActivePure) Zelle von EcoQuest sowie Breeze AT Ozongeneratoren bezüglich der Reduzierung mikrobiologischer Populationen auf Edelstahloberflächen M.T. Ortega, L.J. Franken, P.R. Hatesohl und J.L. Marsden Fachbereich Fleischtechnologie Institut für Lebensmittelwissenschaft der Kansas State University Kansas State University, Manhattan, KS 66506 Zusammenfassung und Auswirkungen Diese Studie wurde durchgeführt, um den möglichen Einsatz der Radiant Catalytic Ionization (ActivePure) Zelle von EcoQuest zur Inaktivierung von Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Streptococcus spp., Pseudomonas aeruginosa, Bacillus spp., Staphylococcus aureus, Candida albicans, und S. chartarum auf Edelstahloberflächen nach unterschiedlichen Kontaktzeiten innerhalb einer Kammer mit kontrollierter Luftzufuhr zu untersuchen. Außerdem wurde der Breeze AT Ozongenerator von EcoQuest unter identischen Bedingungen zur Inaktivierung von Candida albicans und S. chartarum bewertet. Verbesserte Desinfektionstechnologien für Oberflächen, die mit Nahrungsmitteln in Berührung kommen, sind notwendig, um pathogene Keime, die in Nahrungsmitteln vorhanden sind, in lebensmittelverarbeitenden Bereichen einzudämmen. Erst vor kurzer Zeit wurden auf den Einsatz von Ozon basierende Technologien für die Verwendung auf Oberflächen, die mit Lebensmitteln in Berührung kommen, zugelassen. Diese Untersuchung beurteilt die Verwendung von gasförmigem Ozon und anderen oxidativen Gasen auf Edelstahloberflächen bei Vorhandensein der oben genannten Mikroorganismen. Beide Technologien reduzierten die Populationen aller untersuchten Mikroorganismen auf den Edelstahloberflächen um mindestens 90 % nach einer Verweildauer von 24 Stunden. Die RCI Zelle (ActivePure) reduzierte den mikrobiellen Keimbefall bei kürzerer Verweildauer wirksamer als der Breeze AT Ozon‐ Generator. Einleitung Die Lebensmittel‐ und Getränkeindustrie wird bei der Herstellung von sicheren und gesunden Produkten mit einer Reihe von Problemen konfrontiert. Pathogene Keime in Lebensmitteln wie E. coli 0157:H7, Listeria monocytogenes und Salmonella spp. sind in den vergangenen Jahren ein immer größeres Problem geworden. Lebensmittelverarbeitende Betriebe setzen sich auch mit Mikroorganismen auseinander, die den Verderb begünstigen und die Haltbarkeit von Produkten verkürzen und dadurch den Unternehmen alljährlich Kosten in Millionenhöhe für verdorbene Produkte bringen. Betriebe auf dem Gebiet der Fleischverarbeitung, der Verarbeitung von Meeresfrüchten, Geflügel, Milchprodukten, Bäckereien, Konservenhersteller sowie verarbeitende Betriebe in fast allen anderen Segmenten des Marktes sind betroffen. Das US Landwirtschaftsministerium schätzt die Kosten, die in Verbindung mit durch Lebensmittel hervorgerufenen Krankheiten entstehen, auf $ 5,50 bis $ 22 Millionen pro Jahr. Enthalten sind hier noch nicht die Milliarden Dollar, die jedes Jahr durch verdorbene Produkte, die entsorgt oder zu verbilligten Preisen verkauft werden müssen, entstehen. Bessere Desinfektionsmaßnahmen und bessere Kontrollmaßnahmen für Mikroorganismen werden in fast allen Bereichen der Lebensmittelindustrie benötigt. Als desinfizierendes Mittel wirkt Ozon stark oxidierend auf Substanzen. Es wirkt tausendmal schneller als Chlor und desinfiziert Wasser drei‐ bis viermal so effektiv. Wenn Ozon eine Substanz oxidiert, zerstört es buchstäblich die Moleküle der Substanz. Es kann organische Substanzen wie Bakterien und Schimmelpilze oxidieren, Luft sterilisieren und Gerüche und giftige Dämpfe zerstören. Die Industrie verwendet Ozon auf vielfältige Weise als Geruchshemmer, Wasserreiniger und als Desinfektionsmittel (Mork, 1993). Vor kurzem hat die Regierung Ozon zur Verwendung mit Lebensmitteln und auf Oberflächen, die mit Lebensmitteln in Kontakt kommen, zugelassen und damit die Tür für weitere Einsatzmöglichkeiten dieser Technologie geöffnet. Im Juni 2001 hat die US Food and Drug Administration [Arzneimittelzulassungsbehörde USA] Ozon als Desinfektionsmittel sowohl für die Verwendung auf Oberflächen, die mit Lebensmitteln in Kontakt kommen, als auch zur direkten Anwendung auf Lebensmittelprodukte zugelassen. Vorher war Chlor das in der Lebensmittelindustrie am häufigsten verwendete Desinfektionsmittel. Ozon ist möglicherweise die bessere
  • 7. Alternative zur Desinfektion von Oberflächen als Chlor. Chlor ist eine auf Halogen basierende Chemikalie, die eine korrodierende Wirkung auf Edelstahl und andere in der Lebensmittelverarbeitung verwendete Metallflächen hat. Chlor stellt außerdem ein beträchtliches Gesundheitsrisiko für die Mitarbeiter dar. Selbst wenn es nur in kleinen Mengen mit Ammoniak oder säurehaltigen Reinigungsmitteln vermischt wird, können giftige Gase entstehen. Chlor ist ein in der Fleischverarbeitung häufig verwendetes Desinfektionsmittel und ist wirksam und auch sicher in der Anwendung, wenn es in den richtigen Konzentrationen verwendet wird. Chlor ist jedoch insgesamt weniger wirksam als Ozon und kann zur Bildung von Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Methylchlorid sowie Tri‐halomethanen führen. Im Gegensatz dazu entstehen bei Ozon nach dem Oxidationsprozess keine Restprodukte. Ein wichtiger Vorteil der Verwendung von Ozon in der Lebensmittelverarbeitung ist die Tatsache, dass ein Produkt nach der Behandlung „biologisch“ (bio) genannt werden kann. Biologische Desinfektionsmittel müssen bei der EPA [amerikanische Umweltschutzbehörde] als Desinfektionsmittel für Oberflächen, die mit Lebensmitteln in Kontakt kommen, eingetragen sein. Ozon ist bei der EPA registriert und wurde von der FDA [Arzneimittelzulassungsbehörde USA] als Desinfektionsmittel für Oberflächen, die mit Lebensmitteln in Kontakt kommen, sowie für die Anwendung an Lebensmitteln selbst, zugelassen. In den vergangenen Jahren wurde Ozon zunehmend zur Verwendung in der Lebensmittelverarbeitung akzeptiert und wird derzeit nicht nur zur Anwendung auf Oberflächen eingesetzt. Eine neuere Empfehlung der FDA aus dem Jahr 2004 erklärt „ Ozon ist eine Substanz, die den Befall von schädlichen Mikroorganismen einschließlich pathogener Keime wie E. coli Stämme und Cryptosporidium in Säften reduzieren kann. Ozon ist ein zugelassener Lebensmittelzusatzstoff, der gefahrlos als antimikrobieller Wirkstoff bei der Behandlung, Lagerung und Verarbeitung bestimmter Lebensmittel unter den in 21 CFR 173.368 beschriebenen Bedingungen eingesetzt werden kann.“ Materialien und Methoden Ansetzen der Kulturen: Für die Untersuchung wurden folgende Bakterien‐ und Pilzkulturen verwendet: Bacillus globigii (ATCC # 31028, 49822, 49760), Staphylococcus aureus (AT # 10832D, 25178, 11987), Candida albicans (ATCC # 96108, 96114, 96351), Stachybotrys chartarum (ATCC # 18843, 26303, 9182), Pseudomonas aeruginosa (ATCC # 12121, 23315, 260) Escherichia coli (ATCC # 27214, 19110, 67053), Streptococcus pneumoniae (ATCC # 27945, 29514, 10782) und Staphylococcus aureus – Methycillin resistent – (ATCC # 33591). Die Kulturen wurden entsprechend der Hinweise der ATCC [American Type Culture Collection] wiederbelebt. Bakterien‐, Hefe‐ und Schimmelstämme wurden jeweils separat in Kaseinpepton‐Sojamehl‐Bouillon (TBS, Difco Laboratories, Sparks, MD) sowie in Hefe‐Malz‐Pepton (YM Difco Laboratories) bis zur mittleren Wachstumsphase gezogen. Darauf folgte eine Spülung und Resuspendierung in 0,1 % Pepton‐Wasser. Die 8 Kulturen wurden nach Arten bis zu ca. 10 KBE/ml kombiniert. Vorbereitung der Proben und Ozonbehandlung: Die zur Bewertung des Ozongenerators verwendeten mikrobiellen Arten wurden als mikrobieller Cocktail auf 6.3 x 1,8 cm #8 Edelstahlobjektträger (17,64 cm² beidseitige Fläche) gebracht. Vier Edelstahlobjektträger wurden in die mikrobielle Kulturmischung getaucht und 15 Sekunden verwirbelt, um eine optimale Verteilung der Mikroorganismen zu erreichen. Mit sterilen Klemmen wurden die Edelstahlobjektträger für eine Stunde zum Trocknen auf ein Abkühlgestell in einer Sterilbank gehängt. Die Anfangspopulation der Mikroorganismen auf den Edelstahlobjektträgern reichte von 5 bis 6 KBE/cm². Die beimpften Edelstahlobjektträger wurden bei 26 °C und 46 % relativer Luftfeuchtigkeit (Umgebungsbedingungen) in eine Testkammer mit kontrollierter Luftzufuhr (Mini Environmental Enclosure, Terra Universal, Anaheim, Kalifornien) umgesetzt und 0, 2, 6 und 24 Stunden lang mit der RCI Zelle von EcoQuest behandelt. Der EcoQuest Breeze AT Ozongenerator wurde separat für die Behandlungszeiträume von 0, 2, 6 und 24 Stunden untersucht. Während der gesamten Untersuchung wurde der Ozongehalt beobachtet (Model 500, Aeroqual, Neuseeland).
  • 8. Stichprobenentnahme: Nach der Beendigung der Ozonkontaktzeit wurden die Träger 30 Sekunden lang mit 30 ml 0,1 % Pepton‐Wasser verwirbelt. Proben, die mit den Bakterienkulturen beimpft waren, wurden fortlaufend verdünnt, in Kaseinpepton Agar angelegt (TSA, Difco Laboratories) und bei 35°C 24 Stunden lang inkubiert. Nach der Vorbereitung von Lösungsreihen wurden die Hefeproben in Kartoffel‐Glukose‐Agar (PDA, Difco Laboratories), die mit Schimmelkulturen versehenen Proben auf Maismehlträger angesetzt. Sowohl die Kartoffel‐Glukose‐ Agar‐Probe als auch die Maismehlprobe wurde 5 Tage lang bei 30°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Ergebnisse für jeden Mikroorganismus als koloniebildende Einheiten pro cm² (KBE/cm²) dargestellt. Ergebnisse und Diskussion: Die Reduzierung der mikrobiellen Populationen auf #8 Edelstahlobjektträgern nach 0, 2, 6 und 24 Stunden Betriebszeit der RCI Zelle von EcoQuest werden in Abbildung 1 dargestellt. Der Kontakt mit einem Ozongehalt von 0,02 ppm für die Dauer von 2 Stunden reduzierte alle untersuchten mikrobiellen Populationen um mindestens 0,7 log KBE/cm². Längere Kontaktzeiten führten zu stärkeren Reduzierungen, der höchste Reduzierungsgrad wurde nach einer Kontaktzeit von 24 Stunden festgestellt. Nach einer Kontaktzeit von 24 Stunden waren die durchschnittlichen mikrobiellen Reduzierungen für jeden Mikroorganismus folgendermaßen verteilt: S. aureus (1,85 log KBE/cm², E. coli (1,81 log KBE/cm²), Bacillus spp. (2,83 log KBE/cm²), S. aureus metr (2,98 log KBE/cm²), Streptococcus spp. (1,64 log KBE/cm²), P. aeruginosa (2,0 log KBE/cm²), L. monocytongnes (2,75 log KBE/cm²), C. albicans (3,22 log KBE/cm²) und S. chartarum (3,32 log KBE/cm²). Die Reduzierung der mikrobiellen Population nach der Behandlung der Edelstahlobjektträger mit dem EcoQuest Breezer AT Ozongenerator wird in Abbildung 2 dargestellt. Reduzierungen von mindestens 0,2 und 0,4 log KBE/cm² wurden nach jeweils 2 bzw. 6 Stunden Ozonkontakt beobachtet. Nach einer Kontaktzeit von 24 Stunden betrugen die Reduzierungen für C. albicans und S. chartarum jeweils 1,48 bzw. 1,32 log KBE/cm². Die RCI (AcitvePure) Zelle von EcoQuest und der Breeze AT Ozongenerator von EcoQuest reduzierten beide die mikrobiellen Populationen auf Edelstahloberflächen innerhalb von 2 Stunden unter normalen Umgebungsbedingungen. Größere Reduzierungen wurden bei längerer Betriebsdauer beobachtet. Die RCI (ActivePure) Zelle hatte hinsichtlich der Reduzierung mikrobieller Populationen bei kürzeren Kontaktzeiten von 2 und 6 Stunden einen höheren Wirksamkeitsgrad als der Breeze AT Ozongenerator. Diese Untersuchung hat bewiesen, dass Ozongas das Potential hat, als wirksames Oberflächendesinfektionsmittel in der Lebensmittelverarbeitung eingesetzt zu werden. Die Untersuchungen werden derzeit fortgesetzt und nicht behandelte Kontrollproben werden beurteilt. Während Phase II des Projekts, das zum Ende dieses Jahres abgeschlossen sein wird, wird die Wirksamkeit des Systems zur Beseitigung der durch Luft übertragenen Verunreinigungen bewertet, wobei die gleichen Mikroorganismen und oxidativen Technologien verwendet werden. Quellenangaben Mork, D.D. 1993. Removing sulfide with ozone. Water Contamination & purification. 34‐37 U.S. Food and Drug Administration [FDA] 2004. Recommendations to processors of apple juice or cider on the use of ozone for pathogen reduction purposes. Zugang am 27. Juli 2005 unter http://www.cfsan.fda,gov/dms/juicgu13.html.
  • 9. Abb. 1 Dekontaminierung hochglänzender Edelstahloberflächen unter Verwendung der RCI (Active Pure) Zelle von EcoQuest Keimzahl (Log10 KBE/cm²) Mikrobielle Arten • Reduzierung nach 24 Stunden Abb. 2 Dekontaminierung durch Ozon bei hochglänzenden Edelstahloberflächen unter Verwendung des Breeze AT Ozongenerators von EcoQuest Keimzahl (Log10 KBE/cm²) Mikrobielle Arten • Reduzierung nach 24 Stunden
  • 10. Auswirkungen der ActivePure (RCI) Technologie Bzgl. der Reduzierung der Vogelgrippe A (H5N8) auf Oberflächen* in 12‐Stunden‐Tests Vogelgrippe Typ A (H5N8) Inaktivierung mit ActivePure (RCI) Infizierte Zellen – Zeit Infizierte Zellen Stunden Vogelgrippe Typ A (H5N8) Inaktivierung mit ActivePure (RCI) Prozent der verbleibenden infizierten Zellen ‐ Zeit
  • 11. % der verbleibenden infizierten Zellen Stunden Vogelgrippe Typ A (H5N8) Inaktivierung mit ActivePure (RCI) Prozent der reduzierten infizierten Zellen – Zeit % der reduzierten infizierten Zellen Stunden Untersuchung durchgeführt durch die Kansas State University Ergebnisse der Feldforschung können aufgrund von Umweltbedingungen variieren *Anhand von wissenschaftlichen Untersuchungen wurde demonstriert, dass die ActivePure Technologie von EcoQuest in der Lage ist den Keimbefall auf Oberflächen* deutlich zu reduzieren. Ergebnisse der Feldforschung können aufgrund von Umgebungsbedingungen variieren. Diese Ergebnisse wurden bislang noch nicht von der FDA [US Arzneimittelzulassungsbehörde] bewertet. Diese Produkte dienen nicht der Diagnose, Behandlung, Heilung oder Prävention von Krankheiten. © 2007 EcoQuest International. Alle Rechte vorbehalten EcoQuest™, Healthy Living Technologies ™ (Technologien für gesunde Umwelt), wurde als Markenzheichen von EcoQuest ™ International eingetragen. EcoQuest International „Healthy Living Technologies ® wurden von EcoQuest ™ International eingetragen.
  • 12. Inaktivierung von Vogelgrippe durch ActivePure (RCI) Einleitung Das Influenzavirus, ein Angehöriger des Virenstammes Orthomyxoviridae, wird charakterisiert als umhülltes, einzelsträngiges RNA Virus (6) mit negativer Polarität, das zu jährlichen endemischen Ausbrüchen oder zu schwer wiegenderen weltweiten pandemischen Krankheitsausbrüchen führen kann. Influenza des Typs A infiziert im Allgemeinen Menschen, Schweine, Pferde und Geflügel. Bezüglich einer Pandemie stellt derzeit das hochgradig pathogene Vogelgrippevirus (H5N1) die größte Bedrohung dar, weil dieses Virus derzeit epidemisch in Asien, Europa und Afrika auftritt und weil weiterhin die Gefahr einer pandemischen Verbreitung besteht. Die Veränderung (Reassortment) der genetischen Information des Influenzavirus während des Ausbruchs der Grippe kann zu einem noch stärker ausgeprägten pathogenen und infektiösen Isolat führen, das zu einer möglichen Übertragbarkeit von Mensch zu Mensch führen könnte. Dies hätte verheerende Auswirkungen. Das Influenzavirus breitet sich normalerweise durch Schwebstoffe in der Luft, Tröpfcheninfektion oder durch Kontakt mit infizierten Sekreten oder Infektionsträgern (4) aus. Eine schnelle Eindämmung eines Krankheitsausbruchs ist wichtig für die Verhinderung einer weiteren Verbreitung und zur Minimierung einer möglichen Veränderung (Reassortment) der Viren. Influenzaviren überleben nachgewiesenermaßen bis zu 48 Stunden auf nicht‐porösen Oberflächen und bis zu 12 Stunden auf Materialien wie Stoff, Papier oder Papiertaschentüchern (Auftrag ungefähr 105 TCID50/ml (1)). Zusätzlich zu regelmäßigen Desinfektionsmaßnahmen von Oberflächen ist die Inaktivierung des Influenzavirus in der Luft unter Berücksichtigung der vorherrschenden Übertragungsweisen durch Schwebstoffe und Tröpfcheninfektion von großer Bedeutung (4). Das Vorkommen von aerosolen Schwebstofftröpfchen mit dem pathogenen Virus in der Luft wirkt wie ein Infektionsspeicher und muss durch wirksame Desinfektionsmaßnahmen eingedämmt werden. Die Minimierung der Kontamination der Umgebung mit wirksamsten Dekontaminationsmaßnahmen würde alle weiteren Eindämmungsmaßnahmen bei einem Krankheitsausbruch unterstützen. Das Ziel dieser Studie ist es, die völlige Inaktivierung des Influenza Virus Typ A zu untersuchen. Dazu wird das leicht pathogene Vogelgrippevirus (H5N8) als Ersatz für das hoch pathogene Vogelgrippevirus (H5N1) verwendet, das wir dann der Radian Catalytic Ionization‐Zelle ™ (ActivePure Zelle ™) aussetzen. Das System ActivePure ™ ist ein fortschrittliches Oxidationsverfahren, das eine UV‐Inaktivierung mit hydroxischen Radikalen kombiniert, so dass es zwischen diesen beiden wirksamen Inaktivierungsmethoden zu Synergie‐Effekten kommt. Die Wirksamkeit wird geprüft für getrocknete Kultur auf festen Oberflächen, für in Zellkulturen vermehrte Kultur und für Kultur‐ Aerosol in einer Kontrollkabine. Die Wirksamkeit wird bestimmt, indem geprüft wird, ob die untersuchte und behandelte Zellkultur weniger infektiös ist bzw. überhaupt nicht mehr infektiös ist. Eine Kontrollprobe mit nicht behandelten positiven Zellkulturen wird als Vergleich hinzugezogen. Materialien und Methoden Viren und Zellen. Leicht pathogene Vogelgrippeviren H5N8 (Das Center for Desease Control and Prevention , Atlanta, Georgia hat uns freundlicherweise H5N8 zur Verfügung gestellt) wurden 10 Tage in angebrüteten Hühnereiern (Kansas State University, Fachbereich Geflügel, Manhattan, Kansas) bis etwa 107 log10 TCID50 (wie in Madin Darby Canine Kidney MDCK Zellen festgelegt) vermehrt . Die Zellen wurden in Minimalmedium mit Earle’s Salz und L‐Glutamin (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Kalifornien) sowie 2,2 g/l Natriumbicarbonat (Fisher Scientific, Hampton, NH), allgemein MEM genannt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS, Hyclone Laboratories, Logan, UT), ergänzt durch Antibiotika [2,5 mg/l Amphotericin B; 0,67 g/l Streptomycin und 0,3 g/l Penicillin G (alle von Fisher Scientific)] gehalten. Das Infektiositätsmedium wurde hergestellt, indem MEM 0,1 % TPCK gehandeltes Trypsin (Fisher Scientific) zugesetzt wurde und dies mit Antibiotika ergänzt wurde (2,5 mg/l Amphotericin B, 0,67 g/l Streptomycin und 0,3 g/l Penicillin G).
  • 13. H5N8 Inaktivierung Edelstahlobjektträger vom Typ 302 (McMasterCarr, Atlanta, GA) (2 x 10 cm², Dicke 0,8 mm) wurden bei 121 C 15 Minuten lang mit dem Autoklav‐Verfahren sterilisiert. In einer Biosicherheitsglass‐ II‐ Kammer wurden 100 ◊ 1 im Ei kultiviertes H5N8 auf den Träger verbracht und mit der Spitze einer Pipette verteilt, damit die gesamte Oberfläche bedeckt war. Danach trocknete die Probe ungefähr 10‐15 Minuten lang. Dann wurden die beimpften Träger in einem sterilen Transportbehälter in die Testkabine transportiert. Die Proben wurden so mit Klemmen in der Testkammer befestigt, dass alle Seiten des Trägers von der ActivePure ™Zellen‐Behandlung erreicht werden. Ein Objektträger wurde vor Beginn der ActivePure ™Zellen‐Behandlung entfernt und diente dann als erste Kontrollprobe. Das ActivePure™ Zellen‐Gerät wurde dann eingeschaltet und die Proben wurden nach unterschiedlichen Zeitintervallen (2, 4, 8, 12, 24 Stunden) entnommen. Danach wurden die Proben für die Wiedergewinnung der Viren vorbereitet (wie nachfolgend beschrieben). Wiedergewinnung der Viren Das H5N8 Virus wurde von der Edelstahloberfläche entfernt, indem der Objektträger in eine sterile 50 ml konische Ampulle (Fisher Scientific) mit 5 ml Infektionsmedium getaucht wurde. Die Röhrchen wurden dann 1 Minute lang verwirbelt. Eine Endpunkt‐Verdünnungstitration wurde in MDCK Zellen durchgeführt, indem 220 µl des 5 ml Infektionsmediums mit den darin enthaltenen Viren der ersten von mindestens 6 Kavitäten einer Mikrotiterplatte mit 96 Kavitäten mit den konfluierenden MDCK Zellen hinzugefügt wurde. Dann wurde eine Serie von 1:10 Verdünnungen vorbereitet, indem 20 µl aus der ersten Kavität den nächsten 6 Kavitäten zugefügt wurden, die jede 180 µl des Infektionsmediums enthalten. Die letzte Kavität enthielt nur 200 µl des Infektionsmediums und diente als Negativkontrolle. Die Platten wurden bei 37,5% CO2 48 Stunden lang inkubiert. Für jede Kavität wurde der zytopathische Effekt (CPE) bestimmt und der Virenbefall wurde wie von Reed and Muench (3) berechnet als TCID50/ml notiert Real‐Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (rRT‐PCR) Mit dem QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) wurde virale RNA wiedergewonnen. Für die quantitative Bestimmung der extrahierten Influenza RNA wurde die rRT‐PCR Methode verwendet unter Einsatz einer fluoreszierend markierten TaqMan Sonde. Der rRT‐PCR Primer und die Sonden wurden freundlicherweise von Molecular Genetics Influenza Branch, Centers for Disease Control and Prevention in Atlanta, GA zur Verfügung gestellt. Die Schwelle, ab der erfolgreich Influenza RNA bestimmt werden konnte, lag bei einem FAM Fluoreszenz‐Signal ≥ 3 bei Einsatz des SmartCyclers. Ergebnisse Die durchschnittliche Menge von H5N8, die in allen Experimenten von den Edelstahlobjektträgern gewonnen werden konnten, lag bei 5.35 log10 TCID50/ml. Nach der Behandlung mit ActivePure™ betrug die durchschnittliche log‐Reduzierung der H5N8 Viren 1,85, 2,79, 4,16, 5,35 und 5,35 log10 TCID50/ml nach jeweils 2, 4, 8, 12 und 24 Stunden Kontaktdauer (Abb. 1). Die Zahlen basieren auf wieder gewonnenen infektiösen Viren.
  • 14. Abb.1 Wiedergewinnung von H5N8 nach der Behandlung mit ActivePure™ basierend auf TCID 50 /ml in MDCK Zellen Die durchschnittliche Menge der in allen Experimenten von den Edelstahlobjektträgern wiedergewonnenen viralen H5N8 RNA lag bei 4,00 log10 basierend auf einer quantitativen RT‐PCR für Influenza Viren Typ A. Nach der Behandlung mit ActivePure™ betrug die durchschnittliche log‐ Reduzierung des H5N8 Virus basierend auf der Menge der wiedergewonnenen RNA zwischen 0,23 und 0,54 log10 nach allen Behandlungszeiten (2, 4, 8, 12 und 24 Stunden). Dies weist darauf hin, dass der Mechanismus, der verantwortlich für den Verlust der Infektiosität ist, eher auf eine Zerstörung der Lipidhülle oder des Strukturproteins zurückzuführen ist als auf den Abbau der viralen Nukleinsäure. Abb. 2 Wiedergewinnung von H5N8 RNA nach der Behandlung mit ActivePure™ basierend auf RT‐ PCR
  • 15. Diskussion Um die Inaktivierung des Influenzavirus durch den Einsatz von ActivePure ™ besser zu verstehen, wurde die Wirksamkeit untersucht, indem ein leicht pathogenes Vogelgrippe‐Isolat, H5N8, auf Edelstahloberflächen aufgetragen wurde. Es wurde bestimmt, wie wirksam die Inaktivierung ist. Dabei hielten wir uns an die aktuellen EPA Richtlinien zur Bestimmung von Virusdesinfektionen (2), die die Wiedergewinnung von behandelten Viren als Endpunktverdünnung einschließlich eines TCID50 Wiedergewinnungsversuchs für infektiöse Viren erlaubt. Außer der Wiedergewinnung von infektiösen Viren wollten wir bestimmen, ob eine Zerstörung der viralen RNA vorliegt und verwendeten dazu in unseren Experimenten die spezifisch für Influenza A Viren geeignete quantitative RT‐PCR Methode. Auf der Grundlage der derzeitigen EPA Richtlinien, die eine > 4,0 log10 Reduzierung der Virentiter (2) vorsieht, ergab die ActivePure™ Behandlung während eines Zeitraums von 8 Stunden oder mehr eine erfolgreiche Inaktivierung des H5N8 Isolats (Abb.1) bei einem Anfangskontaminationsniveau von 5,35 log10 TCID50/ml. Zusätzliche Tests sind nötig, um zu untersuchen, ob kürzere Behandlungszeiträume zur vollständigen Inaktivierung bei Kontaminationsniveaus von weniger als 5.35 log10 TCID 50/ml führen würden, was bei einem echten Krankheitsausbruch aussagekräftiger wäre (1, 5). Die Ergebnisse der quantitativen RT‐PCR weisen darauf hin, dass ein Abbau der viralen RNA (Abb.2) nicht der ausschlaggebenden Mechanismus zur Inaktivierung der Viren war, da sich die Menge der wiedergewonnenen RNA nach jeder Behandlungszeit nicht sehr voneinander unterschied, P > 0,05. Andere mögliche virale Ziele sind die Lipidhülle und das Strukturprotein, die wahrscheinlich von der ActivePure™ Behandlung geschädigt wurden. Der Oxidationsprozess dieser Behandlung hat wahrscheinlich die relativ empfindliche Hülle des Influenza‐Virus zerstört. Dies könnte dazu geführt haben, dass die Oberflächenproteinstruktur des Influenza‐Virus, die für das Funktionieren des für die Infektiosität notwendigen Anbindungs‐ und Aufnahmemechanismus von zentraler Bedeutung ist, verändert wurde. Die in dieser Studie gewonnenen Ergebnisse weisen darauf hin, dass eine Behandlung mit dem ActivePure™ System für einen Zeitraum von 8 Stunden dazu führt, dass der erforderliche Inaktivierungsgrad eines Vogelgrippe Isolats, hier H5N8, das als sicherer Stellvertreter für das hoch pathogene H5N1 Isolat verwendet wurde, erreicht wird. Die Funktionsweise dieser Technologie lässt sich wahrscheinlich auf eine Oxidationsreaktion zurückführen, bei der sowohl die Lipidhülle des Virus zerstört wird als auch die Struktur des viralen Proteins, das zur Reproduktion des Virus notwendig ist, verändert wird.
  • 16. Quellenhinweise: