Makalah bioteknologi kultur jaringan

  • 7,530 views
Uploaded on

 

More in: Education
  • Full Name Full Name Comment goes here.
    Are you sure you want to
    Your message goes here
    Be the first to comment
No Downloads

Views

Total Views
7,530
On Slideshare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
0

Actions

Shares
Downloads
119
Comments
0
Likes
2

Embeds 0

No embeds

Report content

Flagged as inappropriate Flag as inappropriate
Flag as inappropriate

Select your reason for flagging this presentation as inappropriate.

Cancel
    No notes for slide

Transcript

  • 1. 1 BAB II PEMBAHASAN 2.1 Pengertian Kultur Jaringan Kultur jaringan merupakan terjemahan dari Tissue culture. Tissue dalam bahasa Indonesia adalah jaringan yaitu sekelompok sel yang yang mempunyai fungsi dan bentuk yang sama, culture diterjemahkan sebagai kultur atau pembudidayaan. Sehingga kultur jaringan diartikan sebagai budidaya jaringan/sel tanaman menjadi tanaman utuh yang kecil yang mempunyai sifat yang sama dengan induknya. Street (1977) mengemukakan terminologi, plant tissue culture is generally used for the aseptic culture of cells, tissues, organs, and their components under defined physical and condition in vitro. Atau: Kultur Jaringan adala kultur aseptik dari sel, jaringan, organ, atau bagian lain yang kompeten untuk dikulturkan dalam komposisi kimia tertentu dan keadaan lingkungan terkendali. Thorpe (1990) melanjutkan defenisi tersebut, plant culture/tissue culture,also referred to as in vitro, aseptik, or sterile culture is an important tool in both basic and applied studies as well as in commercial application. Artinya, kultur jaringan dapat didefenisikan sebagai metode untuk mengisolasi bagian tanaman seperti protoplasma, sel, sekelompok sel, jaringan dan organ dan menumbuhkannya dalam media yang tepat dan kondisi aseptik, sehingga bagian- bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman lengkap. Salah satu teknik bioteknologi yang sering digunakan adalah kultur sel dan jaringan. Menurut Suryowinoto (1991) kultur jaringan dalam bahasa asing disebut sebagai tissue culture, weefsel cultuus, atau gewebe kultur. Kultur adalah budidaya dan jaringan adalah sekelompok sel yang mempunyai bentuk dan fungsi yang sama. Kultur jaringan digunakan sebagai istilah umum yang juga meliputi kultur organ ataupun kultur sel. Istilah kultur sel digunakan untuk berbagai kultur yang berasal dari sel-sel yang terdispersi yang diambil dari jaringan asalnya, dari kultur primer, atau dari cell line atau cell strain secara enzimatik, mekanik, atau
  • 2. 2 disagregasi kimiawi. Terminologi kultur histotypic akan diterapkan untuk jenis kultur jaringan yang menggabungkan kembali sel-sel yang telah terdispersi sedemikian rupa untuk membentuk kultur jaringan. Kultur sel dan jaringan dapat digunakan pada hewan dan tumbuhan. Kultur jaringan hewan merupakan suatu teknik untuk mempertahankan kehidupan sel di luar tubuh organisme. Lingkungan sel dibuat sedimikian rupa, sehingga menyerupai lingkungan asal dari sel yang bersangkutan. Sel yang dipelihara bisa berupa sel tunggal (kultur sel), sel di dalam jaringan (kultur jaringan), maupun sel di dalam organ (kultur organ) (Listyorini, 2001). Teknik pembuatan kultur primer pada kultur sel, jaringan, dan organ hewan pada dasarnya sama. Sel, jaringan, atau organ hewan diambil dari tubuh hewan dan mulai dipelihara di dalam kondisi in- vitro. Selama di dalam kultur primer semua kebutuhan sel baik sebagai sel tunggal (kultur sel), sebagai bagian dari jaringan (kutur jaringan), maupun sebagai bagian organ (kultur organ) harus dipenuhi agar sel dapat hidup dan menjalankan fungsi normalnya. Kultur jaringan pada tumbuhan merupakan salah satu teknik perbanyakan tumbuhan yang menggunakan sel atau organ atau jaringan tumbuhan Kultur jaringan pada suatu tumbuhan merupakan suatu cara membudidayakan suatu jaringan tumbuhan menjadi tumbuhan kecil yang mempunyai sifat seperti induknya (Hendaryono, 1994). 2.2 Tujuan dan Manfaat Kultur Jaringan a. Pengadaan bibit Penyediaan bibit yang berkualitas baik merupakan salah satu faktor yang menentukankeberhasilan dalam pengembangan pertanian di masa mendatang.Pengadaan bibit pada suatu tanaman yang akan dieksploitasi secara besar-besaran dalam waktu yang akancepat akan sulit dicapai dengan perbanyakan melalui teknik konvensional. Pengadaanbibitmembantumemperbanyak tanaman (menyediakan bibit), khususnya untuk tanaman yang sulit dikembangbiakkan secara generatif.Keunggulan bibit hasil kultur jaringan, antara lain: - identik dengan induknya - massal & hemat tempat
  • 3. 3 - waktuyangrelatifsingkat - lebih seragam - mutu bibit lebih terjamin - kecepatan tumbuh bibit lebih cepat Gambar 2.1 Bibit Jati Hasil dari Kultur Jaringan b. Menyediakan bibit bebas virus/penyakit Banyak virus yang tak menampakkan gejalanya, namun bersifat laten, dan akan dapat mengurangi vigor, kualitas dan kuantitas produksi. Virus dalam tanaman induk merupakanmasalah untuk perbanyakan vegetatif tanaman hortikultura secara konvensional. Morrel &Martin (1952) menemukan bahwa pada daerah meristem Martin (1952) menemukan bahwa pada daerah meristem apikal, ternyata kandungan virusnya paling rendah bahkan tidak ada. Hal ini mungkin karena virus bergerak melalui sistem pembuluh, sedang daerah tersebut belum ada sistem pembuluhnya, selain itu aktivitas metabolisme tinggi pada daerah tersebut tidak mendukung replikasi virus, juga konsentrasi auksin yang tinggi menghambat multiplikasi. c. Membantu program pemuliaan tanaman Dengan kultur jaringan dapat membantu program pemuliaan tanaman untuk menghasilkan tanaman yang lebih baik melalui : Keragaman Somaklonal, Kultur Haploid, Embryo Rescue, Seleksi In Vitro, Fusiprotoplas, Transformasi Gen /Rekayasa Genetika Tanaman dll.
  • 4. 4 d. Membantu proses konservasi dan preservasi plasma nutfah Dilakukandengan konservasi in vivo dalam bentuk penyimpanan biji dan tanaman hidup (Kebun Raya), preservasi in vivo dengan cara menyimpan biji. Penyimpanan secara kultur jaringan dapat dilakukan dengan menggunakan teknik pertumbuhan minimal (minimal growth) dan kriopreservasi.Untuk biji ortodoks dalam ruang dengan temperatur dan kelembaban yang terkendali. Masalahnya pada biji rekalsitran (apalagi yang ukuran bijinya besar); perlu secara kultur karingan, yaitu sel-sel kompeten (mampu beregenerasi) disimpan dalam temperatur rendah dan dibekukan dalam cairan nitrogen (Kriopreservasi). Adapun penelitian penyimpanan secara kultur jaringan telah dilakukan suatu lembaga (BSJ) terhadap tanaman ubi-ubian, sepeti ubi kayu, gembili, dan yam. Gambar 2.2 Kebun Raya Bogor e. Memproduksi senyawa kimia untuk farmasi, industri makan dan industri kosmetik Sel-sel tanaman yang dapat memproduksi senyawa tertentu, ditumbuhkan dalam bioreaktor besar. Misalnya untuk produksi senyawa antibiotik dari suatu jenis fungi. Senyawa hasil tersebut bisa didapatkan dari hasil sintesis lengkap; juga dapat merupakan hasil transformasi oleh enzim dalam sel tanaman. Misalnya pewarna merah untuk lipstik dari tanaman, yang disebut dengan biolips (prod. Kosmetik Kanebo). 2.3 TahapanPerbanyakanTanamandenganKulturJaringan Secara umum, tahapan yang dilakukandalam perbanyakan tanaman denganteknik kultur jaringan adalah:
  • 5. 5 1. Pembuatan Media Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakandengan kultur jaringan. Komposisi media yangdigunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akandiperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri darigaram mineral, vitamin, dan hormon. Selain itu,diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, danlain-lain. Zat pengatur tumbuh (hormon) yangditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya maupunjumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringanyang dilakukan. Media yang sudah jadi ditempatkanpada tabung reaksi atau botol-botol kaca. Media yangdigunakan juga harus disterilkan dengan caramemanaskannya dengan autoklaf. Macam media: Ada dua penggolongan media tumbuh: mediapadat dan media cair.Media padat pada umumnya berupa padatangel, seperti agar. Nutrisi dicampurkan pada agar.Media cair adalah nutrisi yang dilarutkan di air.Media cair dapat bersifat tenang atau dalamkondisi selalu bergerak, tergantung kebutuhan. 2. Inisiasi Inisiasi adalah pengambilan eksplan/inokulum dari bagian tanaman yang akandikulturkan. Bagian tanaman yang sering digunakan untukkegiatan kultur jaringan adalah tunas.Inokulum dapat diambil dari potongan yangberasal dari kecambah atau jaringan tanaman dewasa yang mengandung jaringan meristem. Gambar 2.3 Tahap Inisiasi
  • 6. 6 3. Sterilisasi Sterilisasi adalah bahwa segala kegiatandalam kultur jaringan harus dilakukan ditempatyang steril, yaitu di laminar flowdan menggunakan alat-alat yang jugasteril. Sterilisasi juga dilakukan terhadapperalatan, yaitu menggunakan etanol yangdisemprotkan secara merata padaperalatan yang digunakan. Teknisi yangmelakukan kultur jaringan juga harussteril. 4. Multiplikasi Multiplikasi adalah kegiatanmemperbanyak calon tanaman denganmenanam eksplan padamedia. Kegiatanini dilakukan di laminar flow untukmenghindari adanya kontaminasi yangmenyebabkan gagalnya pertumbuhaneksplan. Tabung reaksi yang telahditanami ekplan diletakkan pada rak-rakdan ditempatkan di tempat yang sterildengan suhu kamar. Gambar 2.4 Tahap Multipikasi 5. Pengakaran Fase dimana eksplan akanmenunjukkan adanya pertumbuhan akar yangmenandai bahwaproses kultur jaringan yangdilakukan mulai berjalan denganbaik. Pengamatan dilakukansetiap hari untukmelihat pertumbuhan dan perkembangan akarserta untuk melihat adanya kontaminasi olehbakteri ataupun jamur. Eksplan yangterkontaminasi akan menunjukkan gejala sepertiberwarna putih atau biru (disebabkan jamur)atau busuk (disebabkan bakteri).
  • 7. 7 Gambar 2.5 Pengakaran Kultur Jaringan 6. Aklimatisasi Kegiatan memindahkaneksplan keluar dari ruangan aseptic ke kultur potatau bedeng. Pemindahan dilakukan secarahati-hati dan bertahap, yaitu denganmemberikan sungkup. Sungkup digunakanuntuk melindungi bibit dari udara luar danserangan hamapenyakit karena bibit hasil kulturjaringan sangat rentan terhadap serangan hamapenyakit dan udara luar. Setelah bibit mampuberadaptasi dengan lingkungan barunya makasecara bertahap sungkup dilepaskan danpemeliharaan bibit dilakukan dengan cara yangsama dengan pemeliharaan bibit generatif. Gambar 2.6 Aklimatisasi jati muna hasil kultur jaringan
  • 8. 8 2.4 Laboratorium Kultur Jaringan Pertumbuhan eksplan dalam kultur jaringan diusahakan dalam lingkungan yang aseptik danterkendali. Laboratorium yang efektif merupakan salah satu unsur penting yang ikut menentukan keberhasilan pekerjaan, baik untuk penelitian, mau-pun produksi. Laboratorium sebaiknya dibangun di daerah yang udaranya bersih, tidak banyak debu dan polutan. Bangunan laboratorium kultur jaringan sebaiknya mempunyai pembagian ruangan yang diatur sedemikian rupa sehinggatiap kegiatan terpisah satu dengan yang lainnya, tetapi mudah saling berhubungan dan mudah dicapai. Pembagian ruangan laboratorium kultur jaringan berdasarkan kegiatan- kegiatannya adalah sebagai berikut : a. Ruang Analisa b. Ruang persiapan/preparasi c. Ruang transfer/tanam d. Ruang kultur/inkubasi e. Ruang stok/media jadi f. Ruang timbang/bahan kimia a. Ruang Analisa Ruangan ini biasanya digunakan untuk tempat menganalisis, mengamati dan mendiskusikan hasil perlakuan terhadap eksplan yang telah ditanam terdahulu. Hasil perlakuan yang telah dilakukan terhadap eksplan tertentu perlu diamati untuk melihat perbedaannya dan untuk membandingkannya dengan keadaan awal eksplan sewaktu ditanam. Oleh sebab itu dibutuhkan alat-alat dan ruangan untuk analisa lebih lanjut. Alat-alat dan bahan yang diruangan analisa, antara lain adalah 1) Gambar – gambar informasi tentang kultur jaringan, 2) Bahan – bahan media (di dalan lemari), 3) Alat – alat yang dibutuhkan untuk pengamatan hasil kultur jaringan (milimeter blok, jangka sorong, mistar) biasanya disimpan di lemari. Di dalam ruangan ini umumnya terdapat : - Mikroskop - Objek glass dan cover glass
  • 9. 9 - Mikrotom dan perlengkapannya - Loupe Gambar 1.1 Mikrotom Untuk kebutuhan yang lebih tinggia atau canggih, alat-alat yang berhubungan dengan pengamtan DNA juga dperlukan sperti : inkubator atau water bath , lemari es, sentrifuge, elektroforesisi, pipetmikro dengan berbagai ukuran, eppendorf 1,5 ml dan 25µl,ujung tip dengan berbagai ukuran dan perlengkapan pengamatan (larutan etidium bromide), kamera foto folaroid tipe tertentu atau komputer yang dilengkapi dengan kamera khusus untuk pengamatan DNA (Harahap,2013). b. Ruang Persiapan Ruangan sterilisasi adalah ruangan tempat dimana seluruh alat kultur jaringan dibersihkan. Sebalikya rungan sterilisasi dibagi menjadi dua bagian, yaitu ruangan pertama untuk mensterilkan alat-alat yang tidak terkontaminasi dan ruang kedua digunakan untuk mensterilkan alat-alat yang terkontaminasi. Untuk mensterilkan alat yang tidak terkontaminasi alat yang dibutuhkan dalam ruangan ini adalah westafel dan autoklaf. Untuk mensterilkan alat-alat atau botol yang terkontaminasi haruslah dipisahkan ruangan dan peralatan yang digunakan. Pada laboratorium berskala besar, ruanagn ini dilemgkapi denngan autoklaf yangn khusus digunakan unutk
  • 10. 10 mensterilkan botol yang terkontaminasi, jadi botol-botol yang berisi tanaman yang terkontaminasi terlebih dahulu di autoklaf sebelum dicuci secara bersih di westafel. Jika kita tidak memiliki autoklaf dalam jumlah banyak, kondisi ini dapat diatasi dengan cara memisahkan tempat dan alat pencucian botol terkontaminasi denngan botol yang tidak terkontaminasi. Pengalaman menunjukkan botol terkontaminasi harus dicuci 2 kali untuk memastikan botol benar-benar bersih sbelum dilanjutkan dengan mengautoklafnya. Pembagian ruangan sterilisasi dapat juga dengan cara sebagai berikut : - Kamar mandi, digunakan untuk tempat pencucian botol yang terkontaminasi. - Ruangan yang memiliki westafel, tempat pencucian alat-alat yang bersih. Ruang ini dipergunakan untuk mempersiapkan media kultur dan bahan tanaman yang akan dipergunakan, sebagai tempat mencuci alat-alat laboratorium, dan tempat untuk menyimpan alat-alat gelas. Sesuai dengan fungsinya, maka di-ruangan ini terdiri dari :  Hot plate dengan magnetic stirer  Oven  Pengukur pH, dapat berupa pH meter, atau kertas pH indikator  Autoklaf  Kompor gas  Tempat cuci  Labu takar, gelas piala, erlenmeyer, pengaduk gelas, spatula, petridish, pipet, botol kultur, pisau scapel.
  • 11. 11 Gambar 2.7 Autoklaf c. Ruang Transfer/Tanam Ruang transfer merupakan ruang di mana pekerjaan aseptik dilakukan. Dalamruangan ini dilakukan kegiatan isolasi tanaman, sterilisasi dan penanaman eksplandalam media. Ruangan ini sedapat mungkin bebas dari debu dan hewan kecil, sertaterpisah dan tersekat dengan ruangan lain. Penggunaan AC sangat dianjurkan dalamruangan ini. Ruang transfer dilengkapi peralatan sebagai berikut :  Laminar air flow cabinet, bisa juga enkas  Alat-alat diseksi; pisau bedah/scapel, pinset, spatula, dan gunting.  Hand sprayer yang berisi alkohol 70 %  Lampu bunsen Gambar 2.8 Laminar Air Flow
  • 12. 12 Ruangan ini harus berhubungan dengan ruangan kultur, karena setelah penanaman, maka botol berisi tanaman dibawa ke ruang kultur. Juga harus berhubungan dengan ruang preparasi, untuk kemudahan pengangkatan botol berisi media, alar tanam dan yang lainnya. Ruangan ini juga harus verhubungan dengan ruanga analisa, untuk keperluan pengamatan mikroskopis. Ruanngan ini senantiasa dibersihkan dengan dengan desinfektan seperti karbol. Idealya ruangan-ruangan di dalam laboratorium hendaknya saling berhubungan (Harahap,2013). d. Ruang Kultur/Inkubasi Merupakan ruang yang paling besar dibanding dengan ruangan yang lain. Ruangan ini harus dijaga kebersihannya dan sedapat mungkin dihindari terlalu banyak keluar masuknya orang-orang yang tidak berkepentingan. Ruangan ini berisi rak-rak kultur yang berfungsi untuk menampung botol- botol kultur yang berisi tanaman. Rak ini juga dilengkapi dengan lampu- lampu sebagai sumber cahaya bagi tanaman kultur. Selain rak kultur, ruang kultur juga harus dilengkapi dengan AC, pengukur suhu dan kelembapan, serta timer yang digunakan untuk menghidup-kan dan mematikan lampu secara otomatis. Gambar 2.9 Ruang Kultur Cahaya yang digunakan sebagai penerangan, sebaiknya cahaya putih yang dihasilkan dari lampu flourescent. Lampu flourescent dipakai karena sangat baik dan sangat efisien dalam penggunaan energi bila
  • 13. 13 dibanding dengan lampu pijar. Karena pada lampu pijar, hampir 90 % merupakan energi panas, sehingga mem-pengaruhi ruangan. Intensitas cahaya yang baikdarilampuflourescentadalah antara 100 – 400 ftc (1000 – 4000 lux). Intensitas cahaya dapat diatur dengan menempatkan jumlah lampu dengan kekuatan tertentu. Lampu yang digunakan bisa berupa lampu TL dengan daya 15 watt atau 40 watt,tergantung panjang rak yang dibuat. Jarak antar rak 30 – 35 cm. Sebaiknya travo pada lampu TL dipasang terpisah dari box, (lebih baik kalau dipasang di luar ruangkultur), karena dapat membakar tanaman kultur dan membuat suhu ruang menjadipanas. Selain lampu TL, lampu SL juga dapat dipakai. Pemakaian lampu ini dapat meng-hemat biaya listrik, juga lebih terang. Tinggi rak yang dibuat antara 50 – 60 cm. Dalam satu bidang rak dapat memakai 2 atau 3 lampu SL daya 5 – 10 watt tergantung ukuran panjang rak. Panjang penyinaran/lama penyinaran yang dibutuhkan oleh tiap tanaman berbeda-beda. Berapa lama penyinaran harus diberikan, tergantung pada jenis tanaman dan respon yang diinginkan. Ada kultur yang membutuhkan waktu pe-nyinaran yang terusmenerus, ada yang 14 – 16 jam/hari, ada yang 10 – 12 jam/hari. Rata-rata waktu penyinaran yang efektif adalah 12 – 16 jam/hari. Suhu ruang kultur diatur pada suhu 25 – 28o C. Pada suhu yang terlalu dingin, kulturkadang tidak berkembang dengan baik, begitu juga jika suhu ruang kultur terlalupanas, maka jamur dan bakteri akan berkembang biak dengan cepat dan tanaman menjadi layu. Gambar 2.10 Penampang rak kultur bila memakai lampu SL
  • 14. 14 Gambar 2.11 Penampang rak kultur bila memakai lampu TL Ruang stok/media jadi Ruangan ini berfungsi sebagai ruang untuk menyimpan media tanam yang sudah di autoklaf. Ruang stok sebaiknya dingin dan gelap, serta kebersihannya harus dijaga. Media tanam akan diinkubasi pada ruang ini selama 3 hari sebelum digunakan. Hal ini untuk mengetahui kondisi media tanam apakah steril atau ter-kontaminasi jamur/bakteri. Apabila media terkontaminasi, sebaiknya segera dikeluar-kan dan diautoklaf selama 1 jam pada tekanan 0.14 Mpa.
  • 15. 15 Gambar 2.12 Denah lengkap ruangan laboratorium kultur jaringan e. Ruang Timbang/Bahan Kimia Ruang ini berisi stok bahan-bahan kimia, timbangan analitik, magnetik stirer dan lemari es. Semua kegiatan penimbangan bahan kimia dan pembuatan larutan stok dilakukan di ruangan ini.
  • 16. 16 Gambar 2.13 Ruang Timbangan Berikut skema laboratorium kultur jaringan yang mempunyai 5 ruang sesuai dengan tahapan dan fungsinya masing-masing : Sedangkan pada laboratorium sederhana, ruang tanam, ruang kultur dan ruang stok media dapat digabung menjadi satu ruangan. Sedangkan ruang preparasi /per-siapan dapat digabung dengan ruang bahan kimia (seperti dalam gambar di bawah). Dari 2 ruangan ini, ruang tanam + kultur harus memakai AC. Untuk daerah yang bersuhu dingin, tanpa memakai AC tidak ada masalah.
  • 17. 17 Gambar 2.14 Denah sederhana ruangan laboratorium kultur jaringan 2.5 Proses Sterilisasi Alat Sterilisasi adalah segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan di tempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril. Sterilisasi juga dilakukan terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol yang disemprotkan secara merata pada peralatan yang digunakan. Teknisi yang melakukan kultur jaringan juga harus steril. Peralatan yang kami gunakan yaitu petridish yang berfungsi untuk media pemotongan hasilnya steril karena dalam
  • 18. 18 mensterilisasi sesuai petunjuk. Alat yang kedua yaitu botol kultur yang berfungsi untuk menaruh penanaman eksplan hasilnya juga steril karena sangat hati-hati dalam melakukan sterilisasi. Peralatan yang ketiga yaitu Erlenmeyer yang berfungsi untuk pencucian,hasilnya juga steril karena dalam melakukan pensterilan dilakukan dengan sungguh-sungguh dan menjaga kondisi lingkungan tetap steril. Peralatan yang keempat yaitu scalpel yang berfungsi untuk memotong eksplan,hasil alat tersebut juga steril karena praktikan dalam melakukan sterilisasi selalu dalam keadaan steril dan berhati-hati. Peralatan yang ke lima yaitu pinset yang berfungsi untuk mengambil eksplan,hasil alatnya juga steril karena dalam melakukan pensterilan dilakukan sesuai petunjuk dan keadaan lingkungan serta praktikan steril sehingga tidak ada bakteri yang masuk. Peralatan yang ke enam yaitu aluminium foil yang berfungsi untuk membungkus botol kultur,hasilnya alat tersebut juga steril karena praktikan menggunakan dengan hati-hati dan cermat. Salah satu faktor penentu keberhasilan kultur jaringan adalah tahap sterilisasi. Kegiatan sterilisasi ini meliputi pada: a. Sterilisasi pada lingkungan kerja. b. Sterilisasi pada alat-alat dan media tanam. c. Sterilisasi bahan tanaman (eksplan). Kegiatan sterilisasi ini sangat penting untuk dilakukan, karena kontaminasi pada kultur jaringan dapat berasal dari:  Eksplan, baik kontaminasi eksternal maupun internal.  Organisme kecil yang masuk ke dalam media, seperti semut.  Botol kultur atau alat-alat yang kurang steril.  Lingkungan kerja dan ruang kultur yang kotor.  Kecerobohan dalam bekerja. Dalam sterilisasi bahan tanaman, hal yang penting yang harus mendapat perhatian adalah; bahwa sel tanaman dan kontaminan adalah sama-sama benda hidup. Kontaminan harus dihilangkan tanpa mematikan sel tanaman.
  • 19. 19 Beberapa jenis bahan disenfektan yang dapat digunakan untuk sterilisasi bahan tanaman : No Bahan Konsentrasi Lama perendaman 1 Kalsium hipoklorit 1 – 10 % 5 – 30 menit 2 Natrium hipoklorit 1 – 2 % 7 – 15 menit 3 Hidrogen peroksida 3 – 10 % 5 – 15 menit 4 Perak nitrat 1 % 5 – 30 menit 5 Merkuri klorit (HgCl2) 0.1 – 0.2 % 10 – 20 menit 6 Bethadine 2.5 – 10 % 5 – 10 menit 7 Fungisida 2 g/l 20 – 30 menit 8 Antibiotik 50 – 100 mg/l ½ - 1 jam 9 Alkohol 70 % 1 – 10 menit 10 Bayclin/sunclin 5 – 30 % 5 – 25 menit Bahan-bahan sterilisasi ini pada umumnya bersifat toxic/racun terhadap jaringan tanaman. Pembilasan yang berkali-kali sesudah perendaman eksplan di dalam larutan bahan streilisasi, sangat diperlukan untuk menghilangkan sisa-sisa bahan aktif yang masih menempel dipermukaan bahan tanaman. Dalam sterilisasi, kadang-kadang digunakan dua atau lebih bahan sterilisasi. Misalnya; perendaman dalam alkohol dulu, kemudian dalam bayclin, setelah itu bilas dengan air steril. Dapat juga perendaman di mulai dengan larutan fungisida atau antibiotik, kemudian baru HgCl2dan dibilas dengan air steril. Prosedur mana yang efektif, harus ditentukan melalui percobaan pendahuluan. Sterilisasi bahan tanaman dimulai dengan pencucian dan pembuangan bagian-bagian yang kotor dan mati di bawah pancuran air bersih. Pencucian dapat dilakukan dengan penyikatan menggunakan detergent halus. Kadang-kadang bahan yang sudah bersih dibiarkan dibawah pancuran air selama 30 menit. Hal ini dilakukan untuk memecah koloni kontaminan yang masih menempel dipermukaan agar koloni tersebut lebih peka terhadap bahan-bahan sterilisasi. Juga untuk
  • 20. 20 mengurangi dan menghilangkan senyawa fenol, terutama pada tanaman yang kandungan fenoliknya tinggi. Bahan yang sudah bersih dikecilkan sampai ukuran tertentu. Ukuran ini harus lebih besar dari ukuran eksplan yang direncanakan. Bahan kemudian direndam dalam larutan fungisida/antibiotik. Setelah waktu perendaman tercapai, bahan dicuci bersih dan ditiriskan, kemudian bawa masuk ke dalam laminar. Di dalam laminar eksplan direndam dalam alkohol 70 % selama 1 – 2 menit, dan dibilas dengan air steril sekali. Kemudian rendam eksplan dalam larutan bayclin 20 % + tween-20 2 tetes selama 10 menit. Tween-20 ini berfungsi sebagai perekat. Setelah waktu pe-rendaman tercapai, eksplan dibilas dengan air steril 3 – 5 kali selama 5 menit untuk tiap-tiap pembilasan dan letakkan di dalam petridish yang dialasi tissue steril. Bila semua prosedur sudah dilakukan, berarti bahan tanaman sudah siap di tanam pada media kultur. Prosedur sterilisasi dapat dimodifikasi sesuai dengan kebutuhan, seperti : 1. Fungisida – alkohol – bayclin – bayclin – aquades steril 2. Alkohol – bayclin – bayclin – aquades steril 3. HgCl2 – alkohol – aquades steril 4. Fungisida – bayclin – bayclin – bayclin – aquades steril 1. Sterilisasi alat – alat gelas Botol kultur biasanya kecil potensinya sebagai penyebab kontaminasi, karena selalu diautoklaf dengan media. Alat gelas lain dapat disterilisasi dengan beberapa cara, misalnya ekspos ke radiasi UV, penggunaan larutan desinfestasi atau lebih mudah dengan mengautoklaf atu dengan pemanasan dalam oven pada 180oC selama minimal 3 jam. Alat – alat plastik seperti polypropylene atau polycarbonate mesti disterilisasi dengan autoklaf karena mereka tidak tahan panas kering pada 180oC. Wadah plastic dapat digunakan berulangkali; karena mereka tahan diautoklaf berulangkali tapi akhirnya menjadi sedikit mengkerut (brittle). Untuk sterilisasi panas kering (dalam oven), peralatan seperti scalpel, gunting dan forsep, petri dish, beaker dll, dapat dibungkus dengan kertas atau aluminium foil terlebih dahulu sebelum diautoklaf. Kertas yang diautoklaf
  • 21. 21 kemudian dikeringkann dengan cara meletakkan pada oven dengan suhu 60 – 70oC atau di dalam laminar air flow cabinet sebelum digunakan. 2. Teknik Sterilisasi – manipulasi bahan tanaman Sumber utama kontaminan adalah spora jamur dan bakteri yang membentuk bagian alami dari atmosfer. Dapat diasumsikan bahwa agen kontaminasi ada dimana – mana, misalnya pakaian, kulti, rambut dan nafas si operator, jaringan tanaman, peralatan, bagian luar wadah kultur, permukaan tempat kerja, dan banyak lagi. Udara steril di dalam laminar air flow cabinet memungkinkan kita untuk dengan mudah membuka wadah kultur dan bekerja secara steril. Peralatan dapat disterilisasi dengan mencelupkan pada alcohol 70 – 80% yang diikuti dengan pembakaran (flaming) menggunakan Bunsen burner atau lampu spiritus. Bleach dapat juga digunakan sebagai alternatif untuk mensterilisasi peralatan dengan alcohol. Larutan klorin encer (0.1 – 0.25% klorin) dapat digunakan. Peralatan harus stainless steel, karena bahan lain akan berkarat dengan cepat jika direndam dalam bleach. Secara ringkas langkah berikut mesti dilakukan jika melakukan kegiatan kultur jaringan: 1. Semprot atau usap baigan dalam laminar flow cabinet dengan 70% etil atau isopropyl alcohol sebelum menghidupkan cabinet. Alcohol 70% penting dinguankan, absolute alcohol (95%) tidak membunuh mikroba) 2. Hidupkan cabinet. Jika anda menggunakan lampu UV pastikan anda sudah mematikannya sebelum meletakkan bahan tanaman di dalam cabinet. 3. Semprot semua wadah dan bahan dengan ethanol 70% sebelum meletakkannya dalam cabinet. 4. Cuci tangan dan lengan dengan sabun dan air dan usap dengan 70% ethanol sebelum mengambil tanaman. Penting dicatat bahwa ethanol memiliki efek residual; karenanya sebaiknya menggunakan Hexifoam (desinfektan untuk kulit). 5. Jika menggunakan api, berhati-hatilah
  • 22. 22 6. Atur ruang kerja dalam cabinet sehingga tidak banyak gerakan tangan menyilang di dalam cabinet. 7. Jika bahan tanaman jatuh ke permukaan cabinet, anggap terkontaminasi dan buang 8. Setelah selesai mentransfer kultur, matikan cabinet, semprot atau usap dengan 70% ethanol dan tutup cabinet. Sterilisasi dapat dilakukan dengan cara: 1) Sterilisasi dengan pembakaran Alat-alat yang terbuat dari logam dapat disterilkan dengan cara memanaskan atau membakar di atas lampu spirtus. 2) Sterilisasi dengan udara panas/kering Alat-alat dari gelas seperti cawan petri, erlenmeyer, tabung piala, botol eksplan, tabung reaksi dan sebagainya dapat disterilkan dengan udara panas (oven) pada suhu 130 – 160o C selama 1 – 2 jam. Alat alat ditata tidak terlalu rapat agar sirkulasi udara antar tumpukan alat dapat berjalan lancar, sehingga semua alat dapat disterilkan dan dapat dengan mudah dijaga kesterilannya saat dikeluarkan dari alat sterilisasi. 3) Sterilisasi dengan uap panas (basah) Bahan atau alat dapat disterilkan dengan uap panas atau secara basah pada uap panas biasa atau uap panas dengan tekanan tinggi, secara terus menerus (kontinyu) atau secara terputus putus (diskontinyu), khususnya medium pada suhu atau tekanan yang rendah. Untuk sterilisasi dengan cara ini sering kali menggunakan otoklaf. Sterilisasi medium biasanya dilakukan pada suhu 121o C dengan tekanan 1 atm selama 15-30 menit, namun untuk medium yang tidak mudah rusak dapat dilakukan pada suhu atau tekanan yang sedikit lebih tinggi. 4) Sterilisasi dengan bahan kimia Bahan kimia tertentu sering digunakan untuk sterilisasi alat maupun bahan. Etanol 70% sering digunakan untuk sterilisasi permukaan pada alat yang sering dikombinasi dengan pembakaran pada api. NOCl (natrium
  • 23. 23 hipoklorit) dan formalin juga sering digunakan untuk sterilisasi permukaan atau disinfestasi permukaan atau disinfeksi permukaan. 5) Sterilisasi lingkungan kerja Lingkungan kerja untuk teknik kultur jaringan dapat dibagi atas lingkungan umum dan lingkungan spesifik. Lingkungan umum adalah ruangan transfer secara keseluruhan, sedangkan lingkungan spesifik adalah lingkungan didalam laminar air flow cabinet dimana proses penanaman eksplan dan prosedur lain seperti isolasi protoplasma dilakukan. 6) Sterilisasi alat-alat dan media Alat-alat yang perlu disterilkan sebelum penanaman adalah: pinset, gunting, gagang scalpel, petridisk, botol-botol kosong, jarum suntik untuk isolasi meristem dan pipet untuk memindahkan suspensi sel. Media dan aquades juga disterilkan dalam autoclave.Untuk aquades sebaiknya dimasukkan dalam wadah kecil misalnya elemeyer 250 ml dengan isi maksimum 100 ml, agar sterilisasi lebih efektif. Untuk media kultur yang tidak mengandung bahan-bahan yang heat-labile, sterilisasi dilakukan dengan autoclave pada suhu 1210 C. 7) Sterilisasi bahan tanaman Pada setiap jenis tanaman, ditemukan juga kontaminan yang berasal dari dalam jaringan tanaman, terutama bakteri.Bakteri-bakteri ini sampai sekarang belum diidentifikasi.Kontaminan internal ini sangat sulit diatasi, karena sterilisasi permukaan tidak menyelesaikan masalah.Pada bahan tanaman yang mengandung kontaminan internal, harus diberi perlakuan antibiotik atau fungisida yang sistemik. Setiap bahan tanaman mempunyai tingkat kontaminasi yang berbeda tergantung dari :  Jenis tanaman  Bagian tanaman yang diperlukan  Morfologi permukaan  Lingkungan tumbuhnya  Umur tanaman  Kondisi tanaman
  • 24. 24  Musim waktu mengambil Sumber kontaminasi dapat barasal dari : a) Eksplan, baik kontaminasi eksternal maupun internal b) Organisme kecil yang masuk ke dalam media. Dengan keadaan di Indonesia, yang pling sering menyebabkan kontaminasi adalah semut. c) Botol kultur atau alat-alat yang kurang steril. d) Lingkungan kerja dan ruang kultur yang kotor (spora di udara) e) Kecerobohan dalam pelaksanaan. Seperti yang dijelaskan diatas, alat-alat yang perlu disterilkan sebelum penanaman adalah : pinset, gunting, gagang scalpel, kertas saring, petri dish, botol-botol kosong, jarum suntik untuk isolasi meristem dan pipet untuk memindahkan suspensi sel. Alat-alat dan kertas saring dibungkus rapi dengan kertas tebal atau ditaruh dalam baki stainless steel dan bakinya dibungkus dengan kain tebal sebelum dimasukkan ke dalam autoclave. Alumunium foil tidak direkomendasikan sebagai pembungkus, karena uap tidak dapat masuk ke dalam bungkusan. Suhu yang digunakan untuk sterilisasi adalah 1210 C pada tekanan 17,5 psi (pounds per squareinch) selama 1 jam. Perhitungan waktu sterilisasi dimulai setelah tekanan yang diinginkan tercapai. Alat-alat yang dipakai ketika penanaman harus dalam keadaan steril.Alat- alat logam dan dapat disterilisasikan dalam autoclave. Alat tanam seperti : pinset dan gunting dapat juga disterilkan dengan pembakaran atau dengan pemanasan, namun pisaunya (blade) dapat menjadi tumpul bila dipanaskan dalam suhu tinggi, oleh karena itu untuk bladenya dianjurkan cara sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit (Syahmi edi, 2007) Dalam sterilisasi alat, ada 2 macam Sterilisasi, yaitu : 1. Sterilisasi luar  Sterilisasi luar merupakan sterilisasi alat-alat dengan menggunakan deterjen/sabun dan air yang mengalir. Botol-botol kultur dicuci dengan cara menggosok seluruh bagian botol (dalam dan luar) dengan menggunakan deterjen/sabun.
  • 25. 25  Kemudian membilas botol-botol kultur tersebut dengan air yang mengalir sampai air mengenai seluruh bagian botol dan membersihkan bekas-bekas deterjen/sabun.  Setelah dibilas dengan air mengalir, botol diletakkan ditempat yang sudah disemprot dengan alkohol 2. Sterilisasi dalam  Sterilisasi dalam dilakukan dengan cara memasukkan botol-botol kultur ke dalam autoclave. Alat-alat yang disterilisasi dengan autoclave adalah alat yang berupa logam dan gelas.  Botol-botol kultur dan alat-alat tanam yang dibungkus dengan kertas dimasukkan kedalam autoclave selama 1 jam. Suhu yang digunakan untuk sterilisasi adalah 1210 C karena pada suhu tinggi tersebut mikroba akan mati pada tekanan 17,5 psi (pounds per squareinch).  Perhitungan waktu sterilisasi dimulai setelah tekanan yang diinginkan tercapai. Pada prinsipnya, peralatan yang digunakan dalam praktikum ini haruslah steril. Karena peralatan yang tidak steril akan dapat menjadi sumber kontaminan sehingga menggagalkan percobaan kultur jaringan yang dilakukan. Selain peralatan seperti : pinset, gunting, gagang scalpel, petridisk, botol- botol kosong, jarum suntik untuk isolasi meristem dan pipet untuk memindahkan suspensi sel, media dan aquades yang digunakan juga harus disterilisasi. Namun terkadang hal itu saja tidaklah cukup karena sterilisitas dari praktikan juga sangat mempengaruhi. Jadi apabila praktikan akan melakukan percobaan, maka praktikan harus membersihkan dirinya terlebih dahulu. Diantaranya praktikan dapat melakukan hal-hal sebagai berikut : mandi, mencuci tangan dan kaki dengan sabun, mengganti pakaian yang bersih atau pakaian khusus praktik, dan usaha- usaha lain yang dapat menghindarkan kontaminasi. 2.6 Metode dalam Kultur Jaringan Metode kultur jaringan dikembangkan untuk membantu memperbanyak tanaman, khususnya untuk tanaman yang sulit dikembangbiakkan secara
  • 26. 26 generatif. Bibit yang dihasilkan dari kultur jaringan mempunyai beberapa keunggulan, antara lain: mempunyai sifat yang identik dengan induknya, dapat diperbanyak dalam jumlah yang besar sehingga tidak terlalu membutuhkan tempat yang luas, mampu menghasilkan bibit dengan jumlah besar dalam waktu yang singkat, kesehatan dan mutu bibit lebih terjamin, kecepatan tumbuh bibit lebih cepat dibandingkan dengan perbanyakan konvensional. Teknik kultur jaringan memanfaatkan prinsip perbanyakan tumbuhan secara vegetatif. Berbeda dari teknik perbanyakan tumbuhan secara konvensional, teknik kultur jaringan dilakukan dalam kondisi aseptik di dalam botol kultur dengan medium dan kondisi tertentu. Karena itu teknik ini sering kali disebut kultur in vitro. Dikatakan in vitro (bahasa Latin), berarti "di dalam kaca" karena jaringan tersebut dibiakkan di dalam botol kultur dengan medium dan kondisi tertentu. Teori dasar dari kultur in vitro ini adalah Totipotensi. Teori ini mempercayai bahwa setiap bagian tanaman dapat berkembang biak karena seluruh bagian tanaman terdiri atas jaringan-jaringan hidup. Oleh karena itu, semua organisme baru yang berhasil ditumbuhkan akan memiliki sifat yang sama persis dengan induknya. Metode perbanyakan tanaman secara in vitro dapat dilakukan melalui tiga cara, yaitu melalui perbanyakan tunas dari mata tunas apikal, melalui pembentukan tunas adventif, dan embriogenesis somatik, baik secara langsung maupun melalui tahap pembentukan kalus. Ada beberapa tipe jaringan yang digunakan sebagai eksplan dalam pengerjaan kultur jaringan. Pertama adalah jaringan muda yang belum mengalami diferensiasi dan masih aktif membelah (meristematik) sehingga memiliki kemampuan regenerasi yang tinggi. Jaringan tipe pertama ini biasa ditemukan pada tunas apikal, tunas aksiler, bagian tepi daun, ujung akar, maupun kambium batang. Tipe jaringan yang kedua adalah jaringan parenkim, yaitu jaringan penyusun tanaman muda yang sudah mengalami diferensiasi dan menjalankan fungsinya. Contoh jaringan tersebut adalah jaringan daun yang sudah berfotosintesis dan jaringan batang atau akar yang berfungsi sebagai tempat cadangan makanan.
  • 27. 27 Jenis Tanaman dalam Kultur Jaringan Kultur jaringan sudah diakui sebagai metode baru dalam perbanyakan tanaman. Tanaman yang pertama berhasil diperbanyak secara besar-besaran melalui kultur jaringan adalah tanaman anggrek, menyusul berbagai tanaman hias, sayuran, buah-buahan, pangan dan tanaman hortikultura lainnya. Selain itu juga saat ini telah dikembangkan tanaman perkebunan dan tanaman kehutanan melalui teknik kultur jaringan. Terutama untuk tanaman yang secara ekonomi menguntungkan untuk diperbanyak melalui kultur jaringan, sudah banyak dilakukan secara industrial. Namun ada beberapa tanaman yang tidak menguntungkan bila dikembangkan dengan kultur jaringan, misalnya: kecepatan multiplikasinya terlalu rendah, terlalu banyak langkah untuk mencapai tanaman sempurna atau terlalu tinggi tingkat penyimpangan genetik. Dalam bidang hortikultura, kultur jaringan sangat penting untuk dilakukan terutama pada tanaman-tanaman yang: 1). Prosentase perkecambahan biji rendah. 2). Tanaman hibrida yang berasal dari tetua yang tidak menunjukkan male sterility. 3). Tanaman hibrida yang mempunyai keunikan di salah satu organnya (bentuk atau warna bunga, buah, daun, batang dll). 4). Perbanyakan pohon-pohon elite dan/atau pohon untuk batang bawah. 5). Tanaman yang selalu diperbanyak secara vegetatif, seperti: kentang, pisang, stroberry dll. 2.7 Kelebihan Dan Kekurangan Kultur Jaringan Kultur jaringan mempunyai kelebihan dan kekurangan dalam pelaksanaannya, yaitu: 2.7.1. Kelebihan:  Sifat identik dengan induknya;  Perbanyakan dalam waktu singkat;  Tidak perlu areal pembibitan yang luas;
  • 28. 28  Tidak dipengaruhi oleh musim;  Tanaman bebas jamur dan bakteri.  Pengadaan bibit tidak tergantung musim  Bibit dapat diproduksi dalam jumlah banyak dengan waktu yang relatif lebih cepat (dari satu mata tunas yang sudahrespon dalam 1 tahun dapat dihasilkan minimal 10.000 planlet/bibit)  Bibit yang dihasilkan seragam  Bibit yang dihasilkan bebas penyakit (menggunakan organ tertentu)  Biaya pengangkutan bibit relatif lebih murah dan mudah  Dalam proses pembibitan bebas dari gangguan hama, penyakit, dan deraan lingkungan lainnya  Dapat diperoleh sifat-sifat yang dikehendaki  Metabolit sekunder tanaman segera didapat tanpa perlu menunggu tanaman dewasa 2.7.2. Kekurangan:  Bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap hama penyakit dan udara luar;  Bagi orang tertentu, cara kultur jaringan dinilai mahal dan sulit;  Membutuhkan modal investasi awal yang tinggi untuk bangunan (laboratorium khusus), peralatan dan perlengkapan;  Diperlukan persiapan SDM yang handal untuk mengerjakan perbanyakan kultur jaringan agar dapat memperoleh hasil yg memuaskan;  Produk kultur jaringan pada akarnya kurang kokoh.  Bagi orang tertentu, cara kultur jaringan dinilai mahal dan sulit.  Membutuhkan modal investasi awal yang tinggi untuk bangunan (laboratorium khusus), peralatan dan perlengkapan.  Diperlukan persiapan SDM yang handal untuk mengerjakan perbanyakan kultur jaringan agar dapat memperoleh hasil yang memuaskan  Produk kultur jaringan pada akarnya kurang kokoh
  • 29. 29 2.8 Teori Totipotensi Sel Kultur jaringan merupakan suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tumbuhan seperti protoplasma, sekelompok sel, jaringan atau organ serta menumbuhkannya dalam kondisi aseptik sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman lengkap kembali. Teori yang mendasari tehnik kultur jaringan adalah teori sel oleh Schawann dan Scheleiden (1838) yang menyatakan sifat totipotensi ( total genetic potential) sel, yaitu bahwa setiap sel tanaman yang hidup dilengkapi dengan informasi genetik dan perangkat fisiologis yang lengkap untuk tumbuh dan berkembang menjadi tanaman utuh, jika kondisinya sesuai . Berdasarkan bagian tanaman yang dikulturkan, secara spesifik terdapat beberapa tipe kultur yaitu kultur pucuk tunas, kultur embrio, kultur akar, kultur ovul, kultur anter, kultur kuncup bunga, kultur kalus dan kultur suspensi. Biondi and Thorpe (Thorpe, 1981) menyatakan bahwa terdapat tiga prinsip utama yang terlibat dalam tehnik kultur jaringan yaitu:  Isolasi bagian tanaman dari tanaman utuh seperti organ, jaringan, dan sel secara aseptik.  Memelihara bagian tanaman tadi dalam lingkungan yang sesuai dan kondisi kultur yang tepat  Pemeliharaan dalam kondisi aseptik Kultur jaringan tanaman bermula dari pembuktian teori totipotensi sel yang dikemukakan oleh Schwann dan Schleiden (1838). Menurut teori ini, setiap sel tanaman hidup mempunyai informasi genetik dan perangkat fisiologis yang lengkap untuk dapat tumbuh dan berkembang menjadi tanaman utuh, jika kondisinya sesuai. 2.9 Percobaan Kultur Jaringan Sejarah kultur jaringan sebenarnya sejalan dengan sejarah perkembangan botani. Beberapa ahli jaman dulu sudah meramalkan bahwa perbanyakan kultur jaringan dapat dilaksanakan. Pemikiran ini didasarkan pada penemuan para ahli yan mendahului mereka serta penemuan mereka sendiri. (Katuuk, 1989).
  • 30. 30 Pada abad 17 seorang ahli matematika Robert Hooke telah menemukan sel. Ia mengatakan bahwa sel-sel dapat disamakan denan batu-batu bangunan alamiah. Kemudian pada tahun 1838 -1839, seorang ahli Biologi M. V. Schleiden dan Theodore Schwann yang telah menjuruskan perhatiannya pada kehidupan sel, menemukan satu konsep baru, bahwa satu sel dapat tumbuh sendiri walaupun telah terpisah dari tanaman induknya. Mereka mengemukakan bahwa segala peristiwa rumit yang terjadi dalam tubuh organisme selama hidup, bersumber pada sel. Dari konep inilah tumbuh pernyataan bahwa satu sel mempunyai kemampuan untuk berkembang. Sel berkembang dengan jalan regenerasi sehingga pada satu saat akan terbentuk satu tanaman sempurna. Kemampuan regenerasi ini disebut “totipotency”. (Katuuk, 1989). Beberapa ahli yang juga telah bekerja mengisi sejarah perkembangan Botani abad 19, adalah Charles Darwin, Louis Pasteur, Justus Van Liebig, Johan Knopp, dan Rechinger. Charles Darwin dikenal dengan julukan “raja penamat”, menemukan hormon pada koleoptil sebangsa rumput. Kemudian Louis Pasteur yan menentang aliran “generatio spontanea” mengemukakan pentingnya sterilisasi. Pada akhir abad 19, Johan Knopp (1817 – 1891) menemukan 10 unsur hara yan penting bagi pertumbuhan tanaman. Dengan penemuannya ini ia dikenal dengan “Knop’s Solution”, beberapa tahun setelah Knopp, Rechinger (1893) telah mencoba mengambil potongan kecil batang poplar dan beet, kemudian memelihara bahan-bahan ini di atas kertas filter lembab. Dari percobaan ini ia menemukan pertumbuhan kalus. Denan mengurangi ukuran potongan tanaman akhirnya ia mengambil kesimpulan bahwa ukuran yan paling baik adalah ukuran kecil namun tidak kurang dari 1,5 cm. (Katuuk, 1989). Kira-kira pada permulaan abad ini, beberapa ahli botani mengembangkan suatu teori, bahwa sel atau jaringan tanaman pada dasarnya dapat ditanam secara terpisah dalam suatu kultur. Sel dan jaringan yang ditanam dengan cara ini memiliki kemampuan untuk regenerasi bagian-bagian yang diperlukan, dalam upayanya untuk bisa tumbuh dengan normal, membentuk kembali menjadi tanaman yang utuh. (Whaterel, 1982). Dengan kata lain, bahwa di dalam masing-masing sel tanaman mungkin mengandung informasi genetik atau sarana fisiologis tertentu yang mampu
  • 31. 31 membentuk tanaman lengkap bila ditempatkan dalam lingkungan yang sesuai. Kemampuan inilah yang kemudian dikenal sebagai totipotensi. (Whaterel, 1982). Pada permulaan abad ke 20 konsep totipotensi terus dikembangkan. Gottlieb Hamberlant seorang ahli Botani bangsa Jerman pada tahun 1902 melanjutkan konsep totipotensi ini secara bersungguh-sungguh. Ia menekankan bahwa embrio tanaman dapat tumbuh dengan jalan memelihara sel-sel veetatif. Walaupun percobaannya gagal namun ia memastikan bahwa sifat totipotensi yan dimiliki oleh sel menyebabkan sel dapat dipisahkan dan dipelihara pada media tumbuh. Bila medianya cocok, sel yang dipisahkan itu akan melanjutkan kehidupannya dan berkembang menjadi satu tanaman baru (Kyte 1987, dalam Katuuk, 1989). Berbagai penelitian telah dilakukan untuk membuktikan pendapat ini. Namun pada saat itu belum berhasil, karena kurangnya pengetahuan para peneliti, khususnya dalam hal kebutuhan nutrisi dan hormone untuk pertumbuhan. Baru beberapa waktu kemudian, yaitu sejak diketemukannya dua macam hormon tanaman, yaitu asam indol asetat dan asam naftalenasetat, telah mulai berhasil dilakukan kultur organ (1920). kultur jaringan (1939). Hingga sekarang kedua hormon tanaman tersebut diyakini memiliki peranan sangat penting artinya dalam kultur jaringan modern. Pada masa-masa tersebut, yaitu masa-masa awal dimana era kultur jaringan baru mulai dikenal, jarang sekali orang dapat berhasil melakukan regenerasi akar, pucuk tanaman, dan organ tanaman lain secara kultur jaringan, sehingga pada saat itu orangpun mulai mempertanyakan kebenaran teori totipotensi tersebut. (Whaterel, 1982). Sesudah Hamberlant, menjalani tahun-tahun pada abad 20, penelitian tentang kultur jaringan tanaman berkembang pesat. Berikut ini adalah rentetan peristiwa penting yan mengisi sejarah perkembangan kultur jaringan sesudah Hamberlant, dirangkum dari Pierik, (1987), Gautherett (1982), dan Butenko (1968). Keterangan ini disusun secara sistematik menurut tahun penemuan1922 Knudson menemukan germinasi asimbiotik biji tanaman angrek secara in vitro. Pengembangan metode kultivasi kultur jaringan dimulaikan oleh dua oran saintis yang sudah bertahun-tahun berusaha bekerja di bidan ini. Mereka adalah White P., dan Gautheret R.1934 White P., sesudah bertahun-tahun gagal, pada tahun ini berhasil mengkulturkan ujung akar tomat.
  • 32. 32 Pada tahun yang sama Gautheret L., mengkulturkan in vitro jaringan kambium tanaman Acer pseudoplanatus, Salix caparaea, dan Sambucus nigra. Pada saat ini ide tentang kultur jaringan dapat dikatakan sudah tercapai namun oleh karena eksplant tidak dipindahkan ke media yang baru, maka perkembangan terhenti sesudah berumur 15 – 18 bulan. Dikatakan bahwa pada saat itu media ternyata kekurangan beberapa unsur yang berfungsi untuk pembelahan sel. 1939 P. R. White seorang peneliti dari Amerika (yang sekarang dianggap sebagai Bapak Kultur Jaringan) melaporkan sejumlah hasil penelitiannya tentang keberhasilan ia menumbuhkan sejumlah tunas dari potongan-potongan kalus tembakau yan ditanam dalam medium cair. (Whaterel, 1982). Walaupun sampai saat itu ia belum berhasil menumbuhkan akar dari tunas- tunas yang diteliti, suatu lankah maju di bidang perbanyakan kultur jaringan telah berhasil dicapai dalam upaya untuk membuktikan sebagian kebenaran dari teori totipotensi. (Whaterel, 1982).  1940 Seorang ahli yang lain, Folke Skoog, ahli fisiologi tanaman dari Universitas Winconsin pada tahun melanjutkan penelitian-penelitian yang dilakukan White dan telah berhasil membuktikan, bahwa hormon-hormon auksin, yaitu IAA dan NAA (yang pada waktu itu dikenal sebagai pemacu pertumbuhan akar dari potongan-potongan dahan), ternyata mampu menghambat awal pertumbuhan tunas. Selanjutnya dengan percobaan- percobaannya menggunakan kultur jaringan tembakau, dia mulai mencari senyawa-senyawa kimia yang dapat berinteraksi dengan senyawa-senyawa auksin serta senyawa-senyawa yang memacu pertumbuhan tunas. (Whaterel, 1982).  1941 Van Overbeek mula-mula menggunakan air kelapa (yang mengandung faktor perangsang pembelahan sel) dalam mengkulturkan embrio Datura.  1943 White menerbitkan bukunya “A Handbook of Plant Tissue Culture” yang memuat pengetahuan serta hasil penemuan pada jaman itu.  1944 Skoog mula-mula mendapatkan tunas adventif dari hasil kultur jaringan.
  • 33. 33  1945-1946 Loo Shi Wei, pertama-tama mengkulturkan apex batang.1949 Vaccin dan Went menciptakan medium Vacin dan Went.1950 Folke Skoog bersama-sama dengan muridnya berhasil menemukan adanya efek pemacu pembentukan tunas yang disebabkan oleh senyawa-senyawa fosfat anorganik maupun senyawa-senyawa organic, yaitu adenine dan adenosin. (Whaterel, 1982).  1952 Morel dan Martin pertama-tama menemukan dahlia yan bebas virus dari hasil kultur meristem.  1954 Muir et al pertama-tama mendapatkan tanaman dari kultur sel. Wetmore, R. H., dan Sorkin S., mengembangkan teori Hamberlant tentang organogenesis yan sekarang dikenal dengan mikropropagasi.  1955, kelompok Skoog menemukan kinetin, yaitu hormone golongan sitokinin yang pertama kali ditemukan. (Whaterel, 1982).  1957 Skoog dan Miller melaporkan hasil penelitian mereka yang sekarang telah dianggap klasik,yaitu mengemukakan ratio sitokinin dan auxin untuk mengatur pembentukkan organ. Mereka menulis satu artikel tentan “Chemical Regulation of Growth and Organ Formulation in Plant Tissue Cultured in Vitro” mengenai keterkaitan kedua golongan hormone, auksin dan sitokinin dalam pengaturan regenerasi akar dan tunas. Penelitian ini selanjutnya menjadi landasan berbagai upaya pembiakan secara kultur jaringan. (Whaterel, 1982). Skoog menyadari besarnya potensi ekonomi dari hasil penelitian-penelitiannya, selanjutnya semakin menekuni bidang kultur jaringan bersama-sama murud-murid dan teman-temannya. (Whaterel, 1982).  Torrey J. C., mendemonstrasikan pembelahan sel yang diisolasikan.  1958 Reinert dan Steward, menemukan regenerasi proembrio dari suspensi sel Daucus carota.K. V. Thimann dari Universitas Harvard melaporkan penemuan-penemuannya pada beberapa kali penerbitan yang dimulai tahun 1958, bahwa hormon-hormon sitokinin mampu melawan efek pertumbuhan tunas apical. Dan mereka berhasil pula membuktikan, bahwa kinetin bersifat memacu pertumbuhan tunas lateral yan biasanya tidak terlihat nyata akibat penaruh dari tunas apical pucuk tanaman. Hal inilah
  • 34. 34 yan selanjutnya menjadi dasar fisiologis dalam upaya meningkatkan jumlah cabang-cabang lateral, yang seperti diketahui sangat penting artinya bai pembiakan secara kultur jaringan. Dalam tahun-tahun berikutnya, banyak peneliti yan memberikan sumbangan pengetahuan yang menunjang keberhasilan usaha pembiakan secara kultur jaringan tersebut.  1960 Cocking E. C., memperoleh sejumlah protoplast dengan jalan degradasi dinding sel menggunakan enzyme.Morel mempropagasikan tanaman angrek melalui kultur meristem.  1962 Murashige T., dan Skoog F., mengembangkan formulasi media kultur yan amat terkenal dan sampai sekarang dipakai di dunia internasional, yaitu media Murashige-Skoog. (Whaterel, 1982). Di sini peranan Murashige sangat penting artinya, karena selain telah memberi sumbangan pengetahuan dasar kultrur sel dan jaringan, usahanya telah mengarah ke penerapan di bidang pembiakan secara kultur jaringan dalam skala komersial. Murashige bersama murid-muridnya di Universitas California telah menyusun prosedur lenkap pembiakan kultur jaringan dari sejumlah besar spesies tanaman yang diketahui bernilai ekonomi tinggi. Pengembangan hasil karya tersebut selanjutnya mendorong pertumbuhan industri-industri pembiakan secara kultur jaringan di Amerika Serikat. (Whaterel, 1982).  1964 Guha S., dan Maheshwari S. C., mendapatkan embrio haploid yan berkembang dari sel polen tanaman Datura.  1965 Vasil dan Hamberlant, berhasil mendapatkan differensiasi sel tembakau yang diisolasikan.  1967 Bourin J. P., dan Nitch J. P., mendapat tanaman haploid dari kultur serbuk tembakau.  1969 Erickson & Jonassen melakukan isolasi protoplas dari suspensi sel Hapopappus.  1970 Power melakukan fusi protoplas.  1971 Takebe et al mula-mula mendapatkan tanaman hasil regenerasi protoplast.
  • 35. 35  1977 Chilton, et al berhasil mengintegrasikan DNA T-plasmid dari Agribacterium tumefaciens pada tanaman.  1981 Larkins dan Skowcroft, pertama-tama memperkenalkan variasi somaklonal.(Katuuk, 1989).  1985 Perkembangan transfer gen pada tanaman berkembang cepat, seperti penggunaan Agrobacterium, particle bombardment (gen gun), electroporasi, mikroinjeksi.  1990 Perkembangan rekayasa genetik dan metabolic pada tananaman berkembang dengan pesat. Pemasaran produk-produk rekayasa genet 2.9. Masalah-masalah Dalam Kultur Jaringan Dalam kegiatan kultur jaringan, tidak sedikit masalah-masalah yang muncul sebagai pengganggu dan bahkan menjadi penyebab tidak tercapainya tujuan kegiatan kultur yang dilakukan. Gangguan kultur secara umum dapat muncul dari bahan yang ditanam, dari lingkungan kultur, maupun dari manusianya. Permasalahan dalam kultur ada yang dapat diprediksi sebelumnya dan ada pula yang sulit diprediksi kejadiannya. Untuk yang tidak dapat diprediksi, cara mengatasinya tidak dapat secara preventif tetapi diselesaikan setelah kasus itu muncul. Adapun masalah-masalah yang terjadi dalam kultur jaringan yaitu: 1. Kontaminasi Kontaminasi adalah gangguan yang sangat umum terjadi dalam kegiatan kultur jaringan. Munculnya gangguan ini bila dipahami secara mendasar adalah merupakan sesuatu yang sangat wajar sebagai konsekuensi penggunaan yang diperkaya.Fenomena kontaminasi sangat beragam, keragaman tersebut dapat dilihat dari jenis kontaminasinya (bakteri, jamur, virus, dll). Upaya mencegah terjadinya kontaminsi:  Biasakan membersihkan berbagai sarana yang diperlukan dalam kultur jaringan.  Yakinkan bahwa proses sterilisasi media secara baik dan benar.
  • 36. 36  Lakukan proses penanaman bahan pada keadaan anda nyaman dan cari waktu yang longgar. 2. Pencoklatan/browning Pencoklatan adalah suatu karakter munculnya warna coklat atau hitam yang sering membuat tidak terjadinya pertumbuhan dan perkembangan eksplan. Peristiwa pencoklatan sesunggguhnya merupakan peristiwa alamiah yang biasa yang sering terjadi. Pencoklatan umumnya merupakan suatu tanda-tanda kemunduran fisiologi eksplan dan tidak jarang berakhir pada kematian eksplan. 3. Vitrifikasi Vitrifikasi adalah suatu istilah problem pada kultur yang ditandai dengan:  Munculnya pertumbuhan dan pertumbuhan yang tidaknormal.  Tanaman yang dihasikan pendek-pendek atau kerdil.  Pertrumbuhan batang cenderung ke arah penambahan diameter  Tanaman utuhnya menjadi sangat turgescent.  Pada daunnya tidak memiliki jaringan pallisade 4. Variabilitas Genetik Bila kultur jaringan digunakan untuk upaya perbanyakan tanaman yang seragam dalam jumlah yang banyak, dan bukan sebagai upaya pemuliaan tanaman maka variasi genetik adalah kendala. Variasi genetik dapat terjadi pada kultur in vitro karena:  Laju multiflikasi yang tinggi, variasi terjadi karena terjadinya sub kultur berulang yang tidak terkontrol  Penggunaan teknik yang tidak sesuai.  Variasi genetik yang paling umum terjadi pada kultur kalus dan kultur - suspensi sel, hal tersebut terjadi karena munculnya sifat instabilitas kromosom mungkin akibat teknis kultur, media atau hormon.  Cara mengatasi masalah variasi genetik tentunya tidak sederhana, harus memperhatikan aspek yang dikulturkan.
  • 37. 37 5. Pertumbuhan dan Perkembangan Masalah utama berkaitan dengan proses pertumbuhan adalah bila eksplan yang ditanam mengalami stagnasi, dari mulai tanam hingga kurun waktu tertentu tidak mati tetapi tidak tumbuh. Untuk menghindari hal itu dapat dilakukan dengan preventif menghindari bahan tanam yang tidak juvenil atau tidak meristematik. Karena awal pertumbuhan eksplan akan dimulai dari sel-sel yang muda yang aktif membelah, atau dari sel-sel tua yang muda kembali. Media juag dapat menjadi sebab terjadinya stagnasi pertumbuhan, karena dari kondisi medialah suatu sel dapat atau tidak terdorong melakukan proses pembelahan dan pembesaran dirinya. Pada proses klutur jaringan yang bersifa inderict embriogenesis, tahapan pembentukan kalus harus dilanjutkan dengan mendorong induksi embriosomatik dari sel-sel kalus. Terjadinya embrio somatik dapat secara endogen atau eksogen. 6. Praperlakuan Masalah pada kegiatan in vitro bukan hanya dari penanaman eksplan saja, pertumbuahn dan perkembangannya dlama botol saja tetapi juga sangat bisa dipengaruhi oleh persyaratan kegiatan prapelakuan. Pada kasus ini masalah akan muncul bila kegiatan prapelakuaan tidak dilakukan. Prapelakuan dilakukan umumnya untuk tujuan-tujuan tertentu, secara umum adalah dalam rangka menghilangkan hambatan. Hambatan apat berupa hambatan kemikalis, fisik, biologis. Hambatan berupa bahan kimia penanganannya harus dimulai dari pengenalan senyawa aktif, potensi gangguan, proses reaksi dan alternatif pengelolaannya. 7. Lingkungan Mikro Masalah lingkungan inkubator juga tidak bisa diabaiakan karena ini juga sering menjadi masalah. Suhu ruangan inkubator sangat menentukan optimasi pertumbuhan eksplan, suhu yang terlalu rendah aatau tinggi dapat mempengaruhi pertumbuhan dan perkembangan pada eksplan. Kebutuhan antara satu tananaman dengan tanaman yang lain berbeda, namunddemikian solusinya sulit dilakukan mengingat umumnya ruangan inkubator suatu ruangan laboratorium kultur jaringan tidak bisa dibuat variasi
  • 38. 38 antara satu ruangan dengan bagian ruangan yang lainnya. Sehingga optimasi pertumbuhan tidak bisa diharapkan sama antara kultur yang satu dengan kultur yang lain. 2.10 Pemuliaan Tanaman Secara In Vitro Pemuliaan secara in vitro adalah salah satu bentuk bioteknologi yang berupa budidaya di atas media dengan nutrsi dalam kondisi steril (Suryowinoto,1996). Pemuliaan in- vitro adalah bagian dari kegiatan pemuliaan tanaman yang dilakukan dengan menggunakan wadah tabung/gelas yang berisi media buatan (bukan tanah) sebagai media tanam. Mengapa alternatif yang harus dipilih dalam rangka menjawab tantangan krisis pangan adalah pemuliaan tanaman secara in vitro ? Hal ini karena tanaman merupakan sumber pangan terbesar yang ada. Selain itu keunggulan proses ini meliputi kemampuan menghasilkan tanaman unggul dalam waktu yang relatif singkat, kemampuan menghasilkan tanaman yang toleran terhadap stress, bebas virus, dan berbagai macam keunggulan lainnya. Teknik pemuliaan tanaman secara in vitro merupakan salah satu upaya untuk melakukan penghematan biaya,waktu,tempat, dan tenaga sehingga diprediksi mampu mewujudkan masa depan yang lebih baik bagi Indonesia . Jika dilihat dari sudut pandang tempat dan waktu, sistem ini mampu menjawab salah satu masalah panyebab penurunan produksi pangan di suatu negara yaitu mengenai menyempitan lahan untuk pertanian yang dari tahun ke tahun semakin menyempit. Dengan menggunakan sistem pemuliaan tanaman secara in vitro masalah ini dapat teratasi, karena hasil pemuliaan tidak harus ditanam langsung dilahan pertanian. Produk pertanian yang dihasilkan melalui proses ini dapat dipanen dalam waktu yang lebih singkat jika dibandingkan dengan produk pertanian yang dihasilkan secara konvensional. Sehingga tenaga yang diperlukan pun relatif lebih kecil , tidak diperlukan adanya tenaga untuk mengolah tanah , menyiangi , mengairi dan sebagainya karena semua telah dilakukan dengan konsep-konsep pertanian modern. Apabila melihat dampak jangka panjang, proses peningkatan hasil produksi pertanian melalui sistem pemuliaan tanaman secara in vitro dapat menghemat anggaran pemerintah sebesar jutaan dolar. Itu sebabnya banyak
  • 39. 39 negara yang tidak memiliki basic agraris tetapi produksi pangan mereka bahkan lebih tinggi dari negara yang memiliki latar belakang sebagai negara agraris. Program ini akan mampu membawa Indonesia menuju kemandirian pangan serta terhindar dari krisis pangan global yang sekarang ini masih menjadi trending topic diberbagai kalangan masyarakat. Mungkin pelaksanaan alternatif tersebut tidak akan semudah yang dibayangkan, karena untuk mendapatkan varietas-varietas unggul dalam rangka memenuhi kebutuhan pangan yang terus meningkat diperlukan proses yang cukup rumit. Selain itu pengetahuan masyarakat pada umumnya mengenai hal ini masih sangat minim dan cenderung tidak peduli . Masyarakat Indonesia seolah-olah bertahan dengan ketradisionalan yang ada. Oleh karena itu peran pemerintah sangat diperlukan . Melalui kebijakan yang jelas, maka para pemulia tidak akan ragu-ragu dalam mengambil berbagai keputusan berkaitan dengan penciptaan berbagai macam varietas unggul yang akan mampu mereduksi ancaman krisis pangan di Indonesia. Tindakan pemuliaan tanaman ini seharusnya lebih ditekankan kepada tanaman serealia seperti padi,jagung ,dan tanaman penghasil bulir lainnya karena banyak dikonsumsi masyarakat Indonesia dan dunia pada umumnya. Rencana yang besar tanpa didukung oleh sumber daya manusia (SDM) yang profesional tidak akan berjalan dengan lancar. Oleh karena itu, kerjasama antara pemulia dengan para petani serta masyarakat harus dilaksanakan secara harmonis . Sebab tanpa adanya mereka yang mendukung program pemuliaan tersebut maka hal itu tidak dapat dilakukan secara maksimal. Jadi, untuk terhindar dari krisis pangan, Indonesia perlu melakukan suatu tindakan nyata berupa menggencarkan gerakan pemuliaan tanaman secara in vitro sehingga melalui program tersebut, Indonesia mampu memproduksi pangan dalam jumlah yang cukup untuk memenuhi kebutuhan pangan penduduknya. Sudah saatnya Indonesia bangkit dari keterpurukan menuju kebangkitan , dari kesederhanaan menuju kemodernan yang positif , dari pertanian konvensional menuju pertanian berbasis teknologi.
  • 40. 40 Hal-hal perlu diperhatikan dalam pemuliaan in vitro adalah 1) eksplan, 2) media yang digunakan, 3) steril condition, dan 4) hormon. Pemuliaan in-vitro dapat dilakukan dengan beberapa teknik sebagai berikut : a. Fusi protoplas Protoplas adalah sel yang telah dihilangkan dinding selnya. Protoplas dapat diperoleh dengan memberikan enzim penghilang dinding sel misalnya selulase, pektinase dan protease. Fusi protoplas dapat dimanfaatkan untuk melakukan persilangan antar spesies atau galur tanaman yang tidak memungkinkaan untuk dilakukan dengan persilangan biasa karena adanya masalah kompatibilitas fisik. Dua buah protoplas dapat difusikan (digabungkan) dengan menggunakan aliran listrik ataupun zat kimia seperti PEG (Poly Ethylen Glicol). Dengan perlakuan fusi protoplas ini dapat diperoleh hybrid yang somatik (hybrid parasexual) jika nukleus dari kedua species mengalami penyatuan (fusi). Selain itu dapat diperoleh juga cybrid (sitoplasmic hybrid), jika yang mengalami fusi hanya sitoplasmanya saja. Hasil fusi yang diperoleh selanjutnya dapat ditumbuhkan dalam medium untuk menghasilkan kalus yang kemudian diinduksi untuk menghasilkan tanaman baru. b. Embryo resque Embrio yang berasal dari hasil persilangan seringkali tidak dapat bertumbuh atau mati karena adanya hambatan dalam penyerbukan dan pembuahan atau pembuahannya terjadi secara normal tetapi embrio mati pada awal tingkat perkembangannya. Keadaan embrio seperti ini dapat diselamatkan dengan teknik embryo resque yaitu pengambilan embrio yang belum matang dari biji dan menumbuhkannya dalam medium buatan untuk menghasilkan plantlet. c. Kultur haploid (haploid culture) Kultur haploid adalah mengkultur tanaman yang eksplannya mempunyai komposisi gamet haploid. Eksplan yang dimaksud dapat diperoleh dari anther. Sehingga teknik untuk menghasilkan tanaman haploid dengan eksplan anther disebut kultur anther. Tanaman haploid adalah tanaman yang mempunyai satu set kromosom dan memiliki kegunaan untuk menghasilkan tanaman homozigot sehingga mempermudah proses seleksi. Melalui tanaman haploid dapat diperoleh
  • 41. 41 tanaman dihaploid yaitu dengan cara merangkapkan kromosom menjadi 2n dengan perlakuan kolkhisin. d. Variasi somaklonal Variasi somaklonal adalah variasi yang timbul karena perbanyakan tanaman melalui kultur in-vitro. Variasi somaklonal dapat disebabkan oleh beberapa factor, yaitu:  Organisasi sel yang digunakan sebagai eksplan. Organisasi sel mempunyai peranan penting dalam hal pemunculan variasi somaklonal. Perbanyakan dengan lewat kultur meristem yang dapat menghasilkan plantlet yang stabil secara genetis sedangkan perbanyakan melalui kalus meningkatkan kemungkinan terjadinya variasi somaklonal.  Variasi pada jaringan sebagai sumber eksplan. Eksplan yang berasal dari sumber yang berbeda mempunyai variasi inheren sehingga dapat muncul sebagai variasi somaklonal.  Abnormalitas pembelahan sel secara in-vitro. Kombinasi yang tidak tepat dalam penggunaan zat pengatur pertumbuhan dapat menyebabkan terjadinya abnormalitas dalam pembelahan sel yang dapat muncul dalam bentuk perubahan jumlah dan struktur kromosom. Variasi somaklonal yang yang terjadi pada kultur in- vitro tanaman dapat dimanfaatkan sebagai salah satu alternatif pemuliaan tanaman karena dapat menghasilkan varietas-varietas baru, misalnya varietas yang memiliki ketahanan terhadap hama dan penyakit. 1. Perbanyakan Tanaman a. Perbanyakan dengan okulasi/penempelan. Sebagai entres dipilih tunas yang mempunyai mata-mata yang besar dan sehat dari cabang berumur kira-kira satu tahun. Pengambilan mata tempel dilakukan dengan membuat irisan agak lengkung horizontal diatas mata sepanjang 1 cm dan pada kedua ujung irisan tersebut dibuat irisan vertikal kebawah sepanjang kira-kira 2,5 cm, lalu dikelupas hingga diperoleh kulit dengan satu mata yang baik dalam bentuk segi empat berukuran 1 x 2,5 cm. Pada batang
  • 42. 42 bawah dikupas kulit kayunya sesuai bentuk dan ukuran mata tempel. Kemudian mata tempel segera ditempelkan. Selanjutnya tempat tempelan dibalut dengan pita plastik dan bagian mata tidak tertutup. b. Penyambungan/grafting Batang bawah dipotong sekitar 10 cm dari pangkal batang dan pada bagian atas dibuat keratan bebentuk huruf V sepanjang 2-3 cm. Selanjutnya dipotong batang atas sepanjang 8-10 cm yang memiliki minimal 2 mata tunas. Pangkal tunas dibuat runcing, agar bisa masuk keujung batang bawah, ikat sambungan tersebut dengan tali plastik. Calon benih ini kemudian diberi sungkup plastik, yang sebelumnya disiram dahulu. Sekitar 21 hari kemudian sungkup dibuka. c. Cangkok Perbanyak vegetatif dengan cara cangkok sebenarnya dapat dilakukan pada tanaman durian, tetapi benih yang dapat diperoleh sedikit dan dapat merusak bentuk pohon induknya sendiri serta sistem perakarannya tidak kuat karena tidak mempunyai akar tunggang. 2. Kultur Pucuk Kultur Pucuk (Shoot culture) adalah teknik mikropropagasi yang dilakukan dengan cara mengkulturkan eksplan yang mengandung meristem pucuk (apikal dan lateral) dengan tujuan perangsangan dan perbanyakan tunas- tunas/cabang-cabang aksilar. Tunas-tunas aksilar tersebut selanjutnya diperbanyak melalui prosedur yang sama seperti eksplan awalnya dan selanjutnya diakarkan dan ditumbuhkan dalam kondisi in vivo. Istilah yang digunakan untuk teknik kultur pucuk ini tergantung dari eksplan yang digunakan. Jika eksplan yang digunakan adalah ujung pucuk-pucuk apikal (panjang ± 20 mm) saja maka tekniknya disebut sebagai “Shoot-tip Culture”, namun bila eksplan yang digunakan adalah ujung pucuk apikal beserta bagian tunas lain dibawahnya disebut sebagai “Shoot Culture”. Besar kecilnya eksplan yang digunakan mempengaruhi keberhasilan kultur pucuk. Semakin kecil eksplan, semakin kecil kemungkinannya untuk terkontaminasi oleh mikroorganisme namun semakin kecil juga kemampuannya untuk beregenerasi
  • 43. 43 dan memperbanyak diri. Sebaliknya, semakin besar eksplan yang digunakan maka semakin besar kemampuannya untuk beradaptasi dalam kondisi in-vitro, namun makin besar juga kemungkinannya untuk terkontaminasi, makin banyak kebutuhannya akan media dan makin besar wadah/botol kultur yang diperlukan. Oleh karena itu perlu diketahui ukuran eksplan yang sesuai untuk masing-masing varietas dan spesies tanaman. Tujuan praktis kultur pucuk adalah untuk perbanyakan vegetatif tanaman, yang mendasari produksi bibit secara komersial. Pucuk awal ini dalam media yang tepat, membentuk pucuk-pucuk baru yang jumlahnya tergantung dari jenis, berkisar dari 4-20 an tunas. Setelah di induksi pembentukan akar pada pucuk, maka akan tumbuh tanaman yang sempurna yang identik dengan induknya atau merupakan fotokopi dari induknya. Kultur pucuk merupakan dasar dari kegiatan perbanyakan dalam laboratorium komersial. Pertumbuhan pucuk, pada umumnya memerlukan zat pengatur tumbuh dalam media. Tahapan pertumbuhan dan tipe pertumbuhan, menentukan jenis dan konsentrasi zat pengatur tumbuh yang dibutuhkan. Auksin yang biasanya dipergunakan dalam kultur pucuk, adalah IAA, NAA dan IBA. Priyono (2004) melaporkan bahwa IAA sangat berperan dalam memperbaiki tingkat pembentukan tunas mikro pada kultur in vitro ruas T trianggulare. Penggunaan 2,4-D biasanya dihindarkan, karena 2,4 D cenderung menginduksi kalus. Dalam kultur pucuk, kalus tidak diinginkan. Sitokinin merupakan bahan yang selalu ditambahkan. Jenis sitokinin yang biasa dipergunakan adalah BAP, 2iP atau kinetin. Dibandingkan jenis sitokinin yang lain, BAP merupakan jenis sitokinin yang lebih umum digunakan dalam in vitro, karena lebih efektif dan stabil (Bhojwani dan Razdam, 1983). Dalam kultur pucuk sangat umum digunakan konsentrasi sitokinin yang relatif lebih tinggi dari auksin. Pada beberapa jenis tanaman berkayu tertentu, diperlukan masa pemantapan kultur dengan memberikan sitokinin dan auksin dalam konsentrasi rendah. Pada jenis tanaman yang demikian, proliferasi pucuk terjadi setelah dipindahkan ke media kedua dengan hanya berisi sitokinin.
  • 44. 44 Manfaat perbanyakan in-vitro (kultur pucuk) dalam industri bibit 1) Dapat digunakan untuk memproduksi bibit dalam jumlah banyak dan waktu yang relatif singkat. Salah satu keunggulan mikropropagasi adalah perbanyakan organ tanaman yang dihasilkannya. Penggunaan hormon pertumbuhan sintetis memungkinkan perbanyakan eksplan dalam jumlah banyak dan waktu singkat. Perbanyakan di dalam wadah kecil memungkinkan dilakukan perbanyakan cepat ini. Dewasa ini telah dilakukan automatisasi dalam mikropropagasi menggunakan mesin pembuat media dan sterilisasi media, pemotongan dan sterilisasi eksplan yang dikendalikan dengan komputer sehingga dapat dilakukan perbanyakan secara lebih cepat dan lebih efisien. 2) Dapat menghasilkan bibit dengan ukuran seragam. Produksi klon secara in vitro dapat dikontrol lebih mudah dbandingkan produksinya dilapangan karena perbanyakan dilakukan dalam wadah kecil. Oleh karena itu bisa dihasilkan klon dengan ukuran yang seragam dalam saat yang bersamaan. Penanaman bibit yang seragam mempermudah pemeliharaan tanaman di lapangan dan panen dapat dilakukan secara serempak. 3) Tidak membutuhkan eksplan dalam jumlah banyak sehingga menghindari kerusakan tanaman induk. Sebaliknya stek, cangkok, penyambungan/penempelan yang intensif dari satu pohon induk dapat mengganggu pertumbuhan tanaman induk bahkan dapat merusaknya. 4) Dapat digunakan untuk perbanyakan cepat tanaman langka, tanaman dengan nilai ekonomis tinggi, atau varietas unggul hasil pemuliaan tanaman. Tahapan Pelaksanaan Mikropropagasi Kultur Pucuk  Tahap 0 : Tahap persiapan, seleksi, dan persiapan bahan induk Tahapan ini dilakukan sebelum eksplan diambil untuk perbanyakan. Pohon induk yang akan digunakan sebagai sumber eksplan harus dipilih secara
  • 45. 45 hati-hati. Pohon ini adalah pohon dari spesies atau verietas yang akan diperbanyak, mempunyai vigor yang sehat dan bebas dari gejala serangan hama atau penyakit. Kadang-kadang pohon induk atau bagian tanaman yang akan diambil sebagai eksplan perlu diperlakukan khusus agar mikropropagasi berhasil. Perlakuan-perlakuan tersebut antara lain : a. Penaman di green house atau pot untuk mengurangi sumber kontaminan, b. Pemberian lingkungan yang sesuai atau perlakuan kimia untuk meningkatkan kecepatan multiplikasi dalam kondisi in-vitro, c. Indexing atau prosedur lain untuk mengetahui adanya penyakit sistemik oleh virus atau bakteri, d. Perangsangan pertumbuhan tunas-tunas dorman, dll.  Tahap 1 : Tahap awal atau induksi (inisiasi) Tahap awal ini amat sangat penting dan menentukan bagi keberhasilan mikropropagasi. Keberhasilan tahap ini pertama kali terlihat dari keberhasilan penanaman eksplan pada kondisi aseptis (bebas dari segala kontaminan) dan harus diikuti dengan pertumbuhan awal eksplan sesuai tujuan penanamannya (misalnya: perpanjangan pucuk, pertumbuhan awal tunas, atau pertumbuhan kalus pada eksplan). Setelah 1 – 2 minggu inkubasi, kultur yang terkontaminasi oleh bakteri atau jamur (baik pada media maupun eksplannya) dibuang. Tahap ini selesai dan kultur bisa dipindahkan ke tahap berikutnya bila eksplan yang tidak terkontaminasi telah tumbuh sesuai dengan harapan (misalnya tunas lateral atau tunas adventif tumbuh). Untuk eksplan yang mengalami kontaminasi berat atau yang sulit untuk disterilisasi maka eksplan terlebih dahulu dapat ditanam pada media inkubasi atau establishment yaitu media yang hanya mengandung gula dan agar saja dengan tujuan untuk isolasi eskplan yang tidak terkontaminasi sebelum diinisiasi pada tahap 1 mikropropagasi.
  • 46. 46 Faktor-faktor yang berpengaruh pada keberhasilan pada tahap ini adalah: · Umur tanaman induk · Umur fisiologis dari eksplan · Tahap perkembangan dari eksplan · Ukuran dari eksplan.  Tahap 2 : Tahap perbanyakan (Multiplikasi) Tujuan dari tahapan ini adalah untuk memperoleh dan memperbanyak tunas. Kultur axenik yang telah dihasilkan pada tahap I dipindahkan pada media yang kaya akan cytokinin agar eksplan dapat menghasilkan tunas yang banyak yang selanjutnya pada tahap III nanti tunas-tunas tersebut dipindahkan pada media pengakaran untuk memacu pertumbuhan akar. Tunas yang diperoleh pada tahapan ini digunakan sebagai bahan perbanyakan berikutnya, oleh karena itu pada tahapan ini dilakukan banyak sub kultur untuk melipatgandakan jumlah plantlet yang dihasilkan. Pada tahap ini tunas yang dihasilkan dibagi-bagi atau dipotong-potong untuk selanjutnya ditanam pada media baru yang umumnya mengandung sitokinin pada konsentrasi yang lebih tinggi dari auksin. Pada tahap ini dapat digunakan media cair (media tanpa agar), semi padat maupun media padat. Dengan modifikasi media yang sesuai, tunas-tunas baru akan tumbuh dari potongan eksplan. Tahapan ini umumnya dilakukan sebanyak 8 – 10 kali sehingga akan dapat dihasilkan sejumlah besar tunas (ribuan tunas) dari satu eksplan pada tahapan inisiasi. Tunas tersebut selanjutnya dibesarkan atau diakarkan pada tahap mikropropagasi berikutnya.  Tahap 3: Persiapan planlet sebelum aklimatisasi (pengakaran) Tunas atau plantlet yang dihasilkan dari tahapan ke 2 tersebut umumnya masih sangat kecil atau tunas yang belum dilengkapi dengan akar sehingga belum mampu untuk mendukung pertumbuhannya dalam kondisi in-vivo. Oleh karena itu, dalam tahap ini masing-masing plantlet yang dihasilkan ditumbuhkan untuk pembesaran, pengakaran dan perangsangan aktifitas fotosintesisnya. Teknik untuk
  • 47. 47 mendapatkan plantula yang siap untuk di pindahkan ke media terrestrial pada tahap IV antara lain, adalah: a) Media untuk pengakaran dan perpanjangan tunas. Media perakaran yang digunakan tanpa penambahan zat pengatur tumbuh. Kluster tunas yang dihasilkan pada tahap II disimpan pada media tanpa ZPT dengan kelembaban yang sangat tinggi. b) Individu tunas (propagul) disubkultur ke media dengan mengurangi konsentrasi atau tanpa penambahan sitokinin dan menambah konsentrasi auxin serta kadang dengan mengurangi konsentrasi senyawa anorganik. Pada beberapa jenis tanaman pengakaran dapat dilakukan dengan cara menempakan tunas hasil tahap II (propagul) diletakan pada aerasi media cair lebih baik dari pada pada media padat. Atau dengan cara memindahkan propagul ke media yang berisi auxin selama 1-2 hari, kemudian disubkultur lagi ke media tanpa auxin (induksi akar dipacu oleh adanya auxin, tetapi pertumbuhan akar dapat dihambat oleh keberadaan auxin dalam media). Atau propagul dicelupkan dalam larutan pangakaran (auxin) sebentar dan selanjutnya ditanam dalam medium tanpa auxin. c) Tahapan pemanjangan ini dapat ditempuh dengan cara meletakan propagul medium agar tanpa atau dengan konsentrasi yang sangat rendah sitokinin selamas 2-4 minggu. Pada beberapa tanaman menggunakan penambahan GA3 dalam medium. Selanjutnya propagul dipindahkan ke media lainnya seperti teknik sebelumnya. d) Penggunaan media praaklimatisasi dan lingkungan kultur dengan penyinaran yang lebih intensitas cahayanya untuk perangsangan aktifitas fotosintesis misalnya penggunaan media dengan konsentrasi gula rendah/tanpa gula, penambahan intensitas cahaya, perlakuan dengan carbon dioksida, dll.  Tahap 4: Aklimatisasi Tahapan aklimatisasi ini adalah tahap pemindahan plantet dari kondisi in- vitro ke kondisi in-vivo. Tahap ini sangat penting dan harus dilakukan secara hati- hati, karena jika tidak dilakukan dengan baik maka sebagian besar plantet yang dihasilkan dapat mati/musnah. Plantlet dikeluarkan dari botol dan agar yang
  • 48. 48 melekat pada akarnya dibersihkan, direndam dalam larutan fungisida, lalu ditanam dalam kompos atau medium porous yang bersih untuk merangsang pembentukan akar-akar serabutnya. Untuk mencegah kematian plantlet akibat transpirasi, plantlet disungkup dengan plastik atau ditempatkan pada ruangan dengan kelembaban tinggi, dengan suhu ruangan dan diletakkan ditempat yang ternaungi dengan intensitas cahaya 30 %. Pada kasus tertentu, daun tanaman disemprot dengan anti transpirant (misalnya Abscicic acid) untuk mencegah penguapan yang terlalu besar dari daun. Secara perlahan, kelembaban dikurangi dan intensitas cahaya ditambah untuk merangsang fotosintesis. (Taji, 2002) Kultur Pucuk untuk Perbanyakan Vegetatif  Anyelir Mikropropagasi Dianthus caryophyllus L, cv. Orange Triumph dapat dilakukan melalui sistem multiplikasi pucuk dan multiplikasi buku tunggal. Medium yang dipakai adalah MS-1 dengan penambahan zat pengatur tumbuh benzilaminopurin (BAP)-asam naftalenasetat (NAA) dan kinetin-NAA. Dalam sistem multiplikasi pucuk, eksplan yang digunakan adalah potongan pucuk apikal. Dalam sistem multiplikasi buku tunggal, eksplan yang digunakan adalah potongan buku batang. Masing-masing eksplan ini dirangsang untuk menghasilkan pucuk pada tahap induksi. Pucuk yang dihasilkan dapat dimultiplikasi pada medium dengan kombinasi dan konsentrasi zat pengatur tumbuh yang memberikan jumlah pucuk tertinggi selama tahap induksi. Pucuk apikal dimultiplikasi pada medium MS-1 dengan 5 pM BAP-0,1 pM NAA dan 10 pM kinetin-0,01 pM NAA. Sanjaya (2004), menyatakan bahwa kemampuan regenerasi dari eksplan tunas apikal berbeda nyata antara klon anyelir. Laju multiplikasi yang dihasilkan dalam 3 kali subkultur adalah masing- masing sebanyak 8-21 pucuk dan 7-19 pucuk per siklus kultur. Buku batang dimultiplikasi pada medium MS-1 dengan 4 pM BAP-0,25 pM NAA. Laju multiplikasi yang dihasilkan dalam 3 kali subkultur adalah sebanyak 6-20 pucuk per siklus kultur. Perakaran semua pucuk hasil multiplikasi ini dapat diinduksi pada medium MS-1 dengan penambahan asam indolbutirat (IBA). Aklimatisasi planlet memberi keberhasilan sebesar 70 persen. Ternyata penanaman satu
  • 49. 49 potongan jaringan pucuk apikal dan buku batang dalam waktu 18 minggu mampu menghasilkan jumlah bibit siap lapang, masing-masing sebanyak sekitar 22.550 dan 12.600 plantlet. Penelitian yang lain menyebutkan bahwa aklimatisasi planlet dari kultur in vitro membutuhkan media yang spesifik untuk tiap kultivar anyelir. Pada media pasir, system perakaran planlet tidak dapat berkembang optimal akibat dari rendahnya ketersediaan hara dalam media. ( Fayakun, 2002)  Tebu Dari penelitian yang dilakukan oleh Baksha et al (2002) mengenai kultur pucuk pada tebu varietas Isd 28, untuk mengetahui effek perbedaan penggunaan jenis dan konsentrasi auksin dan sitokinin pada regenerasi tunas yang ditumbuhkan secara in vitro. Eksplan tanaman adalah bagian tunas pucuk dari tanaman tebu pada fase juvenile (3-4 bulan). Sterilisasi eksplan menggunakan 0.1% HgCl2 setelah dicuci dengan air yang mengalir selama 7-10 menit. Kemudian eksplan dicuci dengan DDH2O (double distilled water) steril pada kondisi aseptic di dalam laminar flow. Eksplan kemudian ditumbuhkan dalam media MS dengan perbedaan kombinasi auksin dan sitokinin untuk mengidentifikasi ketepatan kombinasi media untuk regenerasi tebu melalui kultur pucuk. Media terdiri dari 3% sukrosa, 0.6% agar, dengan pH 5.7 sebelum penambahan agar dan di autoclave pada suhu 1200 selama 15 menit. Eksplant diinkubasi pada 25±20C di bawah fotoperiode 16 jam. Dari penelitian yang dilakukan diketahui bahwa, untuk penggandaan regenerasi pucuk, pertumbuhannya sangat dipengaruhi oleh tipe dan konsentrasi auksin dan sitokinin yang digunakan. Sitokinin BAP lebih efektif daripada Kn dan IBA untuk pembentukan tunas. Rendahnya auksin dan tingginya sitokinin pada medium menginduksi penggandaan regenerasi tunas. Respon maksimum untuk penggandaan inisiasi tunas ditemukan saat eksplan dikultur pada media MS yang ditambah dengan 2.0 mgl-1 BAP + 0.5 mgl-1 IBA, 1.0 mgl-1 BAP + 0.5 mgl-1 IBA dan 1.0 mgl-1 + 0.5 mgl-1 Kn. Pada media ini 70-75% eksplan menghasilkan 2-6 tunas dari pucuk tunggal selama 2-3 minggu. Pertumbuhan tunas pada awalnya tanpa akar, untuk menumbuhkan akar, tunas dipotong terpisah dan diletakkan pada media pengakaran. Konsentrasi yang sama dari IAA (5 mgl-1),
  • 50. 50 NAA atau IBA digunakan tersendiri pada setengah media MS untuk induksi akar yang sebanyak-sebanyaknya. Pertumbuhan akar tunas mungkin dipengaruhi pH, tingkat auksin dan konsentrasi nutrisi pada media induksi akar. Respon terbaik diamati pada 5 mgl-1 NAA yang digunakan pada setengah media MS. Hal tersebut juga telah dikemukakan oleh Heinz ( 1977), yang menyatakan bahwa auksin yang paling bagus digunakan untuk inisiasi akar adalah NAA Perkembangan akar pada media yang mengandung IAA atau IBA memiliki kualitas yang kurang bagus di bandingkan media yang mengandung NAA. Media yang paling efektif untuk penggandaan tunas adalah media MS yang mengandung 2.0 mgl-1 BAP +0.5 mgl-1 IBA, 1.0 mgl-1BAP+0.5mgl-1 IBA dan 1.0 mgl-1 BAP + 0.5 mgl-1 Kn. Lebih jauh penelitian ini menunjukkan bahwa untuk regenerasi tunas kombinasi auksin dan sitokinin penting. Penelitian mengenai mikro propagasi telah memberikan teknologi yang cepat dibandingkan dengan teknik konvensional untuk penggandaan dan preservasi plasma nutfah varietas tebu pilihan. Salah satu kendala dalam kultur pucuk adalah timbulnya pencoklatan (browning) pada pucuk maupun pangkal eksplan. Dari penelitian yang dilakukan oleh Winarsih (2006) pada eksplan tanaman tebu, menunjukkan bahwa penggunaan kloroks dengan konsentrasi 4% paling baik untuk sterilisasi eksplan. 3. Embriogenesis Embriogenesis adalah proses pembentukan dan perkembangan embrio. Proses ini merupakan tahapan perkembangan sel setelah mengalami pembuahan atau fertilisasi. Embriogenesis meliputi pembelahan sel dan pengaturan di tingkat sel. Sel pada embriogenesis disebut sebagai sel embriogenik. Secara umum, sel embriogenik tumbuh dan berkembang melalui beberapa fase, antara lain: 1. Sel tunggal (yang telah dibuahi) 2. Blastomer 3. Blastula
  • 51. 51 4. Gastrula 5. Neurula 6. Embrio / Janin Gambar Proses Embriogenesis 4. Kultur Embrio Kultur Embrio adalah memisahkan embrio yang belum dewasa dan menumbuhkan secara kultur jaringan untuk menghasilkan tanaman viable. Tujuan kultur embrio: 1. memperpendek siklus permuliaan : mempercepat perkecambahan bijiyang umur kecambah lama 2. menguji kecepatan viabilitas biji : lebih efektif dari pada tes pewarnaan 3. memperbanyak tanaman langka : kelapa kopyor 4. memperoleh hybrid langka : mengatasi kegagalan persilangan karena poliferasi terhalang/fertilisasi normal tetapi embrio pada perkembangnnya
  • 52. 52 mati. Kematian karena sedikitnya endosperm sbg cadangan makanan/endosperm tidak berkembang Fungsi Kultur Embrio 1. kultur anther : pembentukan tanaman haploid yang beragam untuk doubling mendapatkan genotip homozigot secara cepat 2. pembentukan genotip transgenic dengan bantuan gen carrier berupa plasmoid 3. meningkatkan ragam genetic berasal dari somaclonal variability dan cellular variant 4. rekombinan genom berasal dari sua spesies atay sub spesies dengan cara hibridisasi somatic/fusi protoplas 5. pemetaan gen pada genom untuk memudahkan usaha transfer gen atau memisahkan blok linkage 6. pemindahan gen berasal dari berbagai donor 7. sintesa spesies tanaman baru, berasal dari wide crossing antara dua spesies atau sub spesies dengan genom yang tidak homolog Faktor penentu keberhasilan kultur embrio 1. factor grnotip : beberapa jenis tanaman mudah di tumbuhkan dan yang sulit ditumbuhkan 2. tingkat perkembangan embrio pada waktu dipisahkan semakin kecil embrio semakin sulit tumbuh 3. kecepatan pertumbuhan tanaman induk : tanaman dari rumah kaca lebih terkontrol sehingga menghasilkan endosperma yang lebih baik daripada tanaman dari luar 4. komposisi media tumbuh : unsure makro, mikro dan gula, ion ammonium dan potassium (penting) 5. oksigen 6. cahaya : perlakuan awal pada tempat gelap 7-14hari, tanaman di pindah ke tempat terang untuk pembentukan klorofil 7. temperature : optimum tergantung jenis (22-28 C)
  • 53. 53 5. Kultur Meristem Meristem merupakan kumpulan sel-sel yang aktif membelah pada tempat tertentu pada tanaman, dimana sel-sel tersebut akan membentuk sistem jaringan secara permanen seperti akar, tunas, daun, bunga dan lain-lain. Sel-sel jaringan meristem mempunyai kemampuan embrionik yang dapat membelah tanpa batas untuk membentuk jaringan dewasa untuk kemudian menjadi organ-organ tanaman. Bentuk dan ukuran titik tumbuh meristem berbeda antara tanaman yang satu dengan lainnya tergantung kelompok tanaman secara taksonomik. Meristem pada tunas tanaman yang tergolong dikotil mempunyai lapisan sel-sel yang membentuk kubah yang sel-selnya aktif membelah berukuran diameter sekitar 0.1-0.2 mm dan panjang 0.2-0.3 mm. Meristem tidak mempunyai vaskuler yang terhubung dengan jaringan phloem dan xylem pada batang. Dibawah sel meristem terdapat sel-sel yang membelah dan memanjang yang berkembang menjadi primordia daun. Kultur meristem merupakan salah satu metoda dalam teknik kultur jaringan dengan menggunakan eksplan berupa jaringan meristematik baik meristem pucuk terminal atau meristem dari tunas aksilar. Tujuan utama aplikasi kultur meristem adalah mendapatkan dan memperbanyak tanaman yang bebas virus (eliminasi virus dari bahan tanaman). Kultur meristem sebagai metoda untuk perbanyakan tanaman yang bebas virus sudah secara luas diaplikasikan terutama pada tanaman hortikultura. Sel-sel meristem pada umumnya stabil, karena mitosis pada sel-sel meristem terjadi bersama dengan pembelahan sel yang berkesinambungan, sehingga ekstra duplikasi DNA dapat dihindarkan. Hal ini menyebabkan tanaman yang dihasilkan identik dengan tanaman donornya (Gunawan, 1988). Jaringan meristem merupakan jaringan vegetatif sehingga plantlet yang dihasilkannyapun merupakan suatu klon. Oleh karena itu kelompok tanaman yang dihasilkan dari kultur meristem sering disebut mericlone. Morel dan Martin (1952) merupakan orang pertama yang berhasil menumbuhkan meristem tanaman dahlia yang terserang virus dan memperoleh tanaman yang bebas virus. Setelah itu penggunaan kultur meristem terhadap
  • 54. 54 berbagai jenis tanaman banyak dikembangkan. Pada tahun 1960 Morel berhasil memperbanyak tanaman Cymbidium yang bebas virus. Dari hasil perbanyakan kultur meristem anggrek tersebut, Morel menemukan pembentukan kalus terlebih dahulu. Dan dari kalus tersebut kemudian membentuk struktur yang serupa dengan perkembangan awal dari perkecambahan biji anggrek sebelum menjadi tanaman. Struktur tersebut disebut dengan protocorm. Protocorm akan memperbanyak diri menjadi massa protocorm yang baru apabila ditumbuhkan pada media tumbuh yang sama dan akan tumbuh menjadi tanaman lengkap (plantlet) apabila dipindahkan ke media pendewasaan dan perakaran. Berbeda dengan Morel yang telah berhasil mengklonkan tanaman anggrek melalui protocorm, Hussey dan Stacey (1960) memperbanyak tanaman kentang secara massal yang bebas virus melalui subkultur tunas aksiler secara berulang. Eksplan tunas kentang yang sudah bebas virus dijadikan eksplan awal ditumbuhkan pada media perbanyakan yang menghasilkan tunas dengan buku- buku yang mengandung tunas ketiak disetiap bukunya. Tiap bulan dapat dihasilkan rata-rata 3-5 buku. Setiap empat minggu buku-buku tersebut dipotong untuk dikulturkan ke media baru. Setelah empat minggu dipotong-potong lagi. Demikian seterusnya sehingga dalam satu tahun dapat dihasilkan jutaan tanaman. Keberhasilan kultur meristem tergantung pada beberapa faktor, diantaranya media kultur, keadaan fisiologis eksplan dan lingkungan fisik tumbuh. Sering terjadi bahwa jaringan meristem yang ditanam tidak menunjukkan proses morfogenesis, hal ini disebabkan sel-sel dari eksplan tidak mengadakan pembelahan dan berdiferensiasi. Jaringan meristem merupakan jaringan yang sel- selnya aktif membelah, biasanya jaringan ini akan mempunyai daya hidup yang lebih besar dan dapat beregenerasi dengan baik apabila ditanam bersama dengan daun primordianya. Akan tetapi lebih disarankan apabila tujuannya untuk mendapatkan tanaman bebas virus sebaiknya meristem ditanam tanpa disertakan daun primordia. 6. Kultur Kalus Dan Kultur Suspensi Sel Kultur kalus merupakan pemeliharaan bagian kecil tanaman dalam lingkungan buatan yang steril dan kondisi yang terkontrol (Pauls, 1995 dalam
  • 55. 55 Kulkarni, 2000). Kalus adalah jaringan yang berproliferasi secara terus menerus dan tidak terorganisasi sehingga memberikan penampilan sebagai massa sel yang bentuknya tidak teratur. Proliferasi jaringan ini dapat dilakukan secara tidak terbatas dengan cara melakukan subkultur sepotong kecil jaringan kalus pada medium yang segar dengan interval waktu yang teratur (George & Sherrington, 1984). Kalus diinduksi dengan melukai jaringan tanaman. Menurut George & Sherrington (1984), pemotongan atau pelukaan jaringan tanaman dapat merangsang pembelahan sel yang berperan dalam inisiasi pembentukan kalus. Kultur kalus ini merupakan materi penting dalam kultur suspensi sel tanaman (Allan 1996 dalam Gürel, 2002). Kultur suspensi sel adalah pemeliharaan sel, tunggal maupun gabungan beberapa sel, dalam medium cair dan lingkungan buatan yang steril. Kultur suspensi sel terdiri atas populasi sel dengan laju pertumbuhan yang cepat karena seluruh permukaan sel dapat kontak langsung dengan medium nutrisi. Hal ini menyebabkan metabolisme sel lebih tinggi jika dibandingkan dengan kultur kalus (George & Sherrington, 1984). Metode kultur suspensi sel dapat digunakan sebagai sarana untuk produksi metabolit sekunder. Hal ini dapat terjadi karena setiap sel tumbuhan yang diisolasi dari tumbuhan induknya mempunyai potensi genetik dan fisiologi yang sama dengan induknya, atau yang dikenal dengan nama sifat totipotensi. Sifat ini menyebabkan metabolit sekunder yang dihasilkan oleh tanaman induk dapat pula dihasilkan pada sel yang dikultur secara in vitro (Fowler, 1981 dalam Mantell & Smith, 1983). Potensi kultur sel untuk memproduksi metabolit telah dibuktikan pertama kali oleh perusahaan farmasi Amerika Pfizer Inc pada tahun 1956. Sedangkan potensi kultur sel untuk memproduksi senyawa bermanfaat terutama untuk obat-obatan, telah dimulai pada akhir tahun 1960 (Pétiard & Bariaud- Fontanel, 1987 dalam Sasson, 1991). Kultur suspensi sel dapat diperoleh dengan cara memindahkan kalus dari medium padat ke medium cair dalam kondisi agitasi selama periode kultur dalam waktu tertentu. George & Sherrington (1984) menyatakan bahwa dalam kondisi agitasi, kalus meremah akan terpisah membentuk kelompok sel dan sel-sel
  • 56. 56 tunggal. Sel-sel tunggal akan mengadakan pembelahan membentuk kelompok- kelompok sel yang kemudian terpisah lagi membentuk sel-sel tunggal dan kelompok-keompok sel yang lebih kecil. Menurut Lim-Ho (1982 dalam George & Sherrington 1984), agitasi dalam kultur suspensi sel dapat meningkatkan aerasi, reduksi polaritas tanaman dan dapat mempertahankan keseragaman distribusi sel- sel dan kelompok sel di dalam medium. Dijelaskan oleh Endress (1994) bahwa agitasi atau pengocokan pada kultur suspensi sel dapat mempengaruhi ukuran agregat, viabilitas dan pertumbuhan sel. Selain itu pengocokan berfungsi untuk meningkatkan oksigen. Diameter sel pada kultur suspensi sel pada umumnya berkisar antara 20- 150 µm dan panjang 100-200 µm. Ukuran ini setara dengan 10-100 kali bakteri atau fungi dan mempunyai panjang maksimal 2 mm serta mengandung 2-200 sel (Endress, 1994). Pada fase pertumbuhan logaritmik pada masa awal kultur sel, sel-sel berbentuk kecil dan dipenuhi dengan sitoplasma. Namun pada fase stasioner, sel-sel ini memiliki ukuran tertentu, sel lebih tua dan memiliki vakuola besar di pusat sel (Endress, 1994). 7. Kultur Anther Anther atau tepung sari secara alamiah berfungsi menyerbuki maupun membuahi. Teknik kultur Anther relative sederhana dan efisien, yang paling penting dalam metode ini adalah penentuan tingkat perkembangan yang paling tepat untuk dijadikan sebagai eksplan sehingga androgenesis dapat terjadi. Anther angiospermae secara skematis dan pembentukan tanaman haploid melalui kultur anther sbb: Kultur anther mempunyai kegunaan sebagai berikut:  Mampu menghasilkan tan. haploid (hanya mempunyai satu genom saja (monohaploid)). Tanaman haploid dapat digunakan untuk pemuliaan tanaman selanjutnya, dari tanaman monohaploid diperkirakan dapat menghilangkan sifat resesif.  Dari monohaploid dapat dihasilkan derivate yang dihaploid (diploid) dengan cara : Merangkap kromosom dengan perlakuan colchicin. Mengadakan silangan tanaman monohaploid.
  • 57. 57  Membuat tanaman homozygote. Faktor-faktor yg mempengaruhi keberhasilan produksi haploid melalui kultur In Vitro adalah :  Tingkat perkembangan polen → paling baik digunakan polen pada tingkat pembelahan mitosis pertama (Uninucleat).  Pre-treatmen → beberapa jenis tanaman memerlukan perlakuan pendahuluan berupa temperatur rendah (3 – 10oC) selama 4 hari (bunga padi), merendam dalam air yang ada butir-butir arangnya atau mengurangi tekanan atm 12 mg/hg.  Media tumbuh → terdiri dari media dasar, gula, hormone, penambah bahan organik (ekstrak pisang, air kelapa, endosperm serealia, ekstrak ragi, alanin dan Co-enzym A, merangsang pertumbuhan Anther.  Kondisi tanaman donor → bunga dari tanaman muda pada saat permulaan pembungaan, lebih baik dari pada bunga yang keluar kemudian. Stadium perkembangan mikrospora dapat dibedakan menjadi beberapa fase, yaitu:  Uni-nukleat sangat awal, dicirikan oleh inti mikrospora di tengah, dinding mikrospora sangat tipis dan tanpa vakuola  Uni-nukleat awal, dicirikan oleh inti mikrospora di tengah, dinding sudah semakin kuat dan vakuola kecil bentuk sferik.  Uni-nukleat tengah awal, dicirikan oleh sebagian besar inti mikrospora di tengah sedangkan sebagian kecil inti mikrospora di tepi, vakuola besar.  Uni-nukleat tengah, hampir sama dengan uninukleat tengah awal tetapi ukuran vakuola dua kali ukuran vakuola pada stadium sebelumnya.  Uni-nukleat akhir, dicirikan oleh hampir semua mikrospora mempunyai inti di tepi, pada beberapa jenis sudah berkembang menjadi stadium 2 inti, vakuola besar berbentuk bulat telur.
  • 58. 58 2.11.Media Kultur Jaringan Media merupakan faktor utama dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Keberhasilan perbanyakan dan perkembangbiakan tanaman dengan metode kultur jaringan secara umum sangat tergantung pada jenis media. Media tumbuh pada kultur jaringan sangat besar pengaruhnya terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan serta bibit yang dihasilkannya. Oleh karena itu, macam- macam media kultur jaringan telah ditemukan sehingga jumlahnya cukup banyak. Nama-nama media tumbuh untuk eksplan ini biasanya sesuai dengan nama penemunya. Media tumbuh untuk eksplan berisi kualitatif komponen bahan kimia yang hampir sama, hanya agak berbeda dalam besarnya kadar untuk tiap-tiap persenyawaan. Media dasar yang sering digunakan dalam kultur jaringan Anthurium sendiri adalah media MS dan modifikasinya ( Pierik et al.,1974; Pierik dan Steegmans, 1976;Kunisaki, 1980; Kuenhle et al., 1992; Chen et al; Hamidah et al., 1997; Teng, 1997;2 ; Rachmawati, 2005), media Nitsch dan modifikasinya (Geir, 1986, 1987, 1988). A. Komposisi Media Tanam Kultur Jaringan Pada umumnya komposisi utama media tanam kultur jaringan, terdiri dari hormon (zat pengatur tumbuh) dan sejumlah unsur yang biasanya terdapat di dalam tanah yang dikelompokkan ke dalam unsur makro, unsur mikro. Hasil yang lebih baik akan dapat kita peroleh bila, kedalam media tersebut, ditambahkan vitamin, asam amino, dan hormon, bahan pemadat media (agar), glukosa dalam bentuk gula maupun sukrosa, air destilata (akuades), dan bahan organik tambahan (Gunawan, 1992). Zat pengatur tumbuh adalah persenyawaan organik selain dari nutrient yang dalam jumlah yang sedikit (1mM) dapat merangsang, menghambat, atau mengubah pola pertumbuhan dan perkembangan tanaman (Moore, 1979 dalam Gunawan, 1992). Zat pengatur tumbuh (ZPT) dalam kultur jaringan diperlukan untuk mengendalikan dan mengatur pertumbuhan kultur tanaman. Zat ini mempengaruhi pertumbuhan dan morfogenesis dalam kultur sel, jaringan, dan organ. Jenis dan konsentrasi ZPT tergantung pada tujuan dan tahap pengkulturan.
  • 59. 59 Secara umum, zat pengatur tumbuh yang digunakan dalam kultur jaringan ada tiga kelompok besar, yaitu auksin, sitokinin, dan giberelin. Auksin digunakan secara luas dalam kultur jaringan untuk merangsang pertumbuhan kalus, akar, suspensi sel dan organ (Gunawan, 1992) Contoh hormon kelompok auksin adalah 2,4 Dikloro Fenoksiasetat (2,4-D), Indol Acetid Acid (IAA), Naftalen Acetid Acid (NAA), atau Indol Buterik Asetat (IBA). Golongan sitokinin berperan untuk menstimulus pembelahan sel dan merangsang pertumbuhan tunas pucuk. Menurut Gunawan (1992), golongan ini sangat penting dalam pengaturan pembelahan sel dan morfogenesis. Sitokinin yang biasa digunakan dalam kultur jaringan adalah kinetin, ziatin, benzilaminopurine (BAP). Dan giberelin untuk diferensiasi atau perbanyakan fungsi sel, terutama pembentukan kalus. Hormon kelompok giberelin adalah GA3, GA2, dan GA1. Penggunaan hormon tersebut harus tepat dalam perhitungan dosis pemakaian, karena jika terlalu banyak maupun terlalu sedikit dari dosis yang diperlukan justru akan menghambat bahkan berdampak negatif terhadap tanaman kultur. Karena interaksi antar hormon dalam suatu media sangat berpengaruh dalam diferensiasi sel. Kebutuhan nutrisi mineral untuk tanaman yang dikulturkan secara in-vitro pada dasarnya sama dengan kebutuhan hara tanaman yang ditumbuhakan di tanah. Unsur-unsur hara yang dibutuhkan tanaman di lapangan merupakan kebutuhan pokok yang harus tersedia dalam media kultur jaringan. Antara lain adalah unsur hara makro dan unsur hara mikro. Unsur-unsur hara tersebut diberikan dalam bentuk garam-garam mineral. Komposisi media dan perkembangannya didasarkan pada pendekatan masing-masing peneliti (Gunawan, 1992). 1. Unsur Hara Makro Adalah hara yang dibutuhkan tanaman dalam jumlah yang banyak. Hara makro tersebut meliputi, Nitrogen (N), Fosfor (P), Kalium (K), Kalsium (Ca), Sulfur (S), Magnesium (Mg), dan Besi (Fe). Kegunaan unsur hara makro tersebut dalam kultur jaringan menurut Qosim, 2006 dalam Sukarasa, 2007 adalah sebagai berikut:
  • 60. 60  Nitrogen (N) Diberikan dalam bentuk NH4NO3, NH2PO4,NH2SO4.Berfungsi untuk membentuk protein, lemak, dan berbagai senyawa organik lain, morfogenesis (pertumbuhan akar dan tunas), pertumbuhan dan pembentukan embrio, pembentukan embrio zigotik dan pertumbuhan vegetatif.  Fosfor (P) Diberikan dalam bentuk KH2PO4.Berfungsi untuk metabolisme energi, sebagai stabilitor membran sel, pengaturan metabolisme tanaman, pengaturan produksi pati/amilum, pembentukan karbohidrat, sangat penting dalam transfer energi, protein, dan sintesis asam amino serta konstribusi terhadap struktur dan asam nukleat.  Kalium (K) Diberikan dalam bentuk CaCl2.2H2O.Berfungsi untuk pemanjangan sel tanaman, memperkuat tubuh tanaman, memperlancar metabolisme dan penyerapan makanan, ion kalsium ditransfer secara cepat menyebrangi membran sel dan mengatur pH dan tekanan osmotik.  Kalsium (Ca) Diberikan dalam bentuk CaCl2.2H2O.Berfungsi untuk merangsang bulu-bulu akar, penggandaan atau perbanyakan sel dan akar, pembentukan tabung polen, dinding dan membran sel lebih kuat, tahan terhadap serangan patogen, mengeraskan batang, memproduksi cadangan makanan.  Sulfur (S) Unsur S merupakan unsur yang penting untuk pembentukan beberapa jenis protein, seperti asam amino dan vitamin B1. Unsur S juga berperan penting dalam pembentukan bitil-bintil akar.  Magnesium (Mg) Diberikan dalam bentuk MgSO4.7H2O.Berfungsi untuk meningkatkan kandungan fosfat, pembentukan protein.
  • 61. 61  Besi (Fe) Diberikan dalam bentuk Fe2(SO4)3;FeSO4.7H2O.Berfungsi sebagai penyangga (chelatin agent) yang sangat penting untuk menyangga kestabilan pH media selama digunakan untuk menumbuhkan jaringan tanaman.Pada tanaman, Fe berfungsi untuk pernapasan dan pembentukan hijau daun. 2. Unsur Hara Mikro Adalah hara yang dibutuhkan dalam jumlah yang sedikit. Unsur hara mikro ini merupakan komponen sel tanaman yang penting dalam proses metabolisme dan proses fisioligi lainnya (Gunawan, 1992). Unsur hara mikro tersebut diantaranya adalah : a. Klor (Cl), diberikan dalam bentu KI. b. Mangan (Mn), diberikan dalam bentuk MnSO4.4H2O. c. Tembaga (Cu), diberikan dalam bentuk CuSO4.5H2O. d. Kobal (CO), diberikan dalam bentuk CoCl2.6H2O. e. Molibdenun (Mo), diberikan dalam bentuk NaMoO4.2H2O. f. Seng (Zn), diberikan dalam bentuk ZnSO4.4H2O. g. Boron (B), diberikan dalam bentuk H3BO3. 3. Usur Tambahan Lainya Vitamin yang paling sering digunakan dalam media kultur jaringan tanaman adalah thiamine (vitamin B1), nicotinic acid (niacin), pyridoxine (vitamin B6). Thiamine merupakan vitamin yang esensial dalam kultur jaringan tanaman karena thiamine mempengaruhi pertumbuhan dan perkembangan sel. Vitamin C, seperti asam sitrat dan asam askorbat, kadang-kadang digunakan sebagai antioksidan untuk mencegah atau mengurangi pencoklatan atau penghitaman eksplan. Mio-Inositol atau meso-insitol sering digunakan sebagai salah satu komponen media yang penting, karena terbukti bersinergis dengan zat pengaturtumbuh merangsang pertumbuhan jaringan yang dikulturkan (Yusnita, 2004).
  • 62. 62 Dalam media kultur jaringan, asam amino merupakan sumber nitrogen organik. Namun sumber N organik ini jarang ditambahkan dalam media kultur jaringan, karena sumber sumber nitrogen utamanya sudah tersedia dari NO3- dan NH4+. Asam amino yang sering digunakan adalah glisin, lysin dan threonine. Penambahan glisin dalam media dengan konsentrasi tertentu dapat melengkapi vitamin sebagai sumber bahan organik (Yusnita, 2004). Gula digunakan sebagai sumber energi dalam media kultur, karena umumnya bagian tanaman atau eksplan yang dikulturkan tidak autotrof dan mempunyai laju fotosintesis yang rendah. Oleh sebab itu tanaman kultur jaringan membutuhkan karbohidart yang cukup sebagai sumber energi. Menurut Gautheret dalam Gunawan (1992), sukrosa adalah sumber karbohidrat penghasil energi yang terbaik melebihi glukosa, maltosa, rafinosa. Namun jika tidak terdapat sukrosa, sumber karbohidrat tersebut dapat digantikan dengan gula pasir. Gula pasir cukup memenuhi syarat untuk mendukung pertumbuhan kultur. Selain sebagai sumber energi, gula juga berfungsi sebagai tekanan osmotik media. Eksplan yang dikulturkan harus selalu bersinggungan atau terkena dengan medianya. Bahan pemadat media yang paling banyak digunakan adalah agar-agar. Agar-agar adalah campuran polisakarida yang diperoleh dari beberapa spesies algae. Dalam analisa unsur, diperoleh data bahwa agar-agar mengandung sedikit unsur Ca, Mg, K, dan Na (Debergh, 1982 dalam Gunawan, 1992). Keuntungan dari pemakaian agar-agar adalah : 1. Agar-agar membeku pada suhu 45° C dan mencair pada suhu 100° sehingga dalam kisaran suhu kultur, agar-agar akan berada dalam keadaan beku yang stabil. 2. Tidak dicerna oleh enzim tanaman. 3. Tidak bereaksi dengan persenyawaan-persenyawaa penyusun media. Selain agar-agar, bahan pemadat media yang semakin banyak disukai adalah Gelrite TM (buatan Kelco). Gelrite adalah gellam gum, suatu hetero-polisakarida yang dihasilkan bakteri Pseudomonas elodea, terdiri dari molekul-molekul K- glukuronat, rhamnosa, dan selobiosa. Sebagai bahan pemadat media gelrite memiliki sifat-sifat yang menguntungkan sebagai berikut :
  • 63. 63  Gelnya lebih jernih.  Untuk memadatkan media dibutuhkan lebih sedikit daripada agar, sekitar 1,5 -3g/l  Lebih murni dan konsisten dalam kualitas. Untuk mencapai kekerasan gel tertentu, pemakaian gelrite lebih rendah dari agar-agar, pada umumnya 2gr/l media. Namun kekerasan gel dari gelrite sangat dipengaruhi oleh kehadiran garam-garam seperti NaCl, KCl, MgCl2.6H2O dan CaCl2. Garam NaCl dan KCl menurunkan kekerasan gel, tetapi MgCl2 dan CaCl2 meningkatkan kekerasan gel (Gunawan, 1992; 57 ). Salah satu kelemahan Gelrite adalah cenderung menaikkan kelembaban nisbi (RH) dalam kultur, sehingga sering menyebabkan terjadinya verifikasi. Gelrite jarang digunakan untuk produksi planlet secara komersial terutama di Indonesia karena harganya mahal (Yusnita, 2003). Kultur yang kurang berhasil, kadang-kadang disebabkan oleh pemakaian air yang kurang murni (Wetherel, 1976). Tidak boleh sembarang air dapat digunakan untuk membuat media kultur. Contohnya air sumur atau air ledeng, dalam air tersebut mengandung banyak kontaminan, bahan inorganik, organik, atau mikroorganisme. Air yang digunakan untuk membuat media harus benar- benar berkualitas tinggi, karena air maliputi lebih adari 95% komponen media. Terhambatnya pertumbuhan tanaman yang dikulturkan dapat disebabkan oleh rendahnya kualitas air yang digunakan. Untuk menghindari hal tersebut, maka sebaiknya digunakan air yang telah dimurnikan atau yang sering kita sebut air destilata (akuades) atau air destilata ganda (akuabides). Dengan alasan ini, sebaiknya sebuah laboratorium kultur jaringan layaknya mempunyai alat penyulingan air (water destilator) atau setidaknya alat pembuat air bebas ion (deionizer). Cara kerja destilator dalam menghasilkan air destilata adalah dengan cara mengubah air menjadi uap air, kemudian mengkondensasikan uap air tersebut. Maka, jadilah air destilata yang tidak lagi berisi mineral atau senyawa organik (Yusnita, 2004). Keasaman (pH) adalah nilai yang menyatakan derajat keasaman atau kebasaan larutan dalam air. Sel-sel tanaman yang dikembangkan dengan teknik kultur jaringan mempunyai toleransi pH yang relatif sempit dengan titik optimal
  • 64. 64 antara pH 5,0 – 6,0 (Daisy, 1994). Faktor pH dalam media juga perlu mendapat perhatian khusus. pH tesebut harus diatur sedemikian rupa sehingga tidak mengganggu fungsi membran sel dan pH dari sitoplasma. Pengaturan pH selain memperhatikan kepentingan beberapa fisiologi sel, juga harus mempertimbangkan faktor-faktor: 1) Kelarutan dari garam-garam penyusun media. 2) Pengambilan (uptake) dari zat pengatur tumbuh dan garam – garam lain. 3) Efisiensi pembekuan agar-agar. Menurut Gamborg dan Shyluk, 1981 dalam Gunawan, 1992, sel-sel tanaman membutuhkan pH yang sedikit asam berkisar antara 5,5–5,8. Pengaturan pH, biasa dilakukan dengan dengan menggunakan NaOH (atau kadang-kadang KOH) atau HCL pada waktu semua komponen sudah dicampurkan (Gunawan, 1992). Beberapa formulasi media yang sudah umum digunakan dalam banyak pekerjaan kultur jaringan antara lain adalah media White, Murashige & Skoog (MS), Gamborg et al. (B5), Gautheret, Schenk & Hilderbrandt (SH), Nitch & Nitch, Lloyd & McCown (WPM) dll. Media MS, SH dan B5 merupakan media yang kaya garam-garam makro. Berikut penjelasan dari masing-masing komposisi media tersebut : 1. Hara Makro Unsur hara makro. terdiri dari enam unsur utama yang dibutuhkan untuk pertumbuhan sel dan jaringan tanaman, yaitu: nitrogen (N), fosfor (P), kalium (K), kalsium (Ca), magnesium (Mg) dan sulfur (S). Konsentrasi optimum yang dibutuhkan untuk mencapai pertumbuhan maksimum bervariasi diantara jenis tanaman. Media kultur harus mengandung sedikitnya 25-60 mM nitrogen anorganik untuk pertumbuhan sel tanaman. Sel-sel tanaman mungkin dapat tumbuh pada sumber N dari nitrat saja, tetapi diketahui bahwa pertumbuhan yang lebih baik adalah apabila mengandung nitrat dan amonium. Nitrat yang disediakan umumnya berkisar 25-40 mM, konsentrasi amonium berkisar antara 2-20 mM. Akan tetapi untuk beberapa spesies tanaman konsentrasi amonium > 8 mM akan menghambat
  • 65. 65 pertumbuhan sel. Sel-sel dapat tumbuh dalam media kultur yang hanya mengandung amonium sebagai sumber nitrogen jika satu atau lebih terdapat asam-asam yang terlibat dalam siklus TCA (seperti sitrat, suksinat, atau malat) juga terdapat dalam media pada konsentrasi sekitar 10 mM. Apabila nitrat dan amonium sebagai sumber nitrogen digunakan bersama dalam media maka ion-ion amonium akan digunakan lebih cepat dibandingkan dengan ion-ion nitrat. Kalium dibutuhkan untuk pertumbuhan sel bagi sebagian besar spesies tanaman. Umumnya media mengandung kalium (dalam bentuk nitrat atau klorida) pada konsentrasi 20-30 mM. Konsentrasi optimum untuk unsur P, Mg, S dan Ca berkisar antara 1-3 mM. Konsentasi yang lebih tinggi dari hara-hara tersebut mungkin diperlukan jika terjadi defisiensi dari hara yang lain. 2. Hara Mikro Unsur hara mikro yang paling dibutuhkan untuk petumbuhan sel dan jaringan tanaman mencakup besi (Fe), mangan (Mn), seng (Zn), boron (B), terusi (Cu) dan molibdenum (Mo). Besi dan seng yang digunakan dalam pembuatan media harus dalam bentuk yang ter ”chelate”. Besi adalah yang paling kritis diantara semua hara mikro. Besi sitrat dan tartrat dapat digunakan untuk media kultur, tetapi senyawa ini sulit untuk larutdan biasanya akan terpresipitasi setelah media dibuat. Masalah ini dipecahkan oleh Murashige & Skoog dengan men ”chelate” besi dengan menggunakan asam etilen diamintetraasetik (EDTA). Kobal (Co) dan iodin (I) juga dapat ditambahkan dalam media tetapi kebutuhan yang jelas untuk pertumbuhan sel belum diketahui. Natrium (Na) dan klorida (Cl) juga digunakan pada beberapa media tetapi tidak begitu penting untuk pertumbuhan sel. Konsentrasi Cu dan Co yang biasanya ditambahkan pada media sekitar 0.1 µM, Fe dan Mo 1 µM, I 5µM, Zn 5-30 µM, Mn 20-90 µM, dan B 25- 100 µM. 3. Karbon dan Sumber Energi Sumber karbohidrat yang biasanya digunakan dalam media kultur adalah sukrosa. Glukosa dan fruktosa dalam beberapa hal dapat digunakan sebagai pengganti sukrosa, dimana glukosa mempunyai efektivitas yang sama dengan
  • 66. 66 sukrosa dibanding dengan fruktosa. Karbohidrat lain yang pernah dicobakan adalah laktosa, galaktosa, rafinosa, maltosa dan pati, tetapi semua karbohidrat tersebut umumnya mempunyai hasil yang kurang baik dibandingkan sukrosa atau fruktosa. Konsentrasi sukrosa normal dalam media kultur berkisar antara 2 dan 3%. Karbohidrat harus tersedia dalam media kultur karena sangat sedikit sel dari jenis tanaman yang diisolasi dapat bersifat autotropik, yaitu kemampuan menyediakan kebutuhan karbohidrat sendiri melalui asimilasi CO2 selama proses fotosintesa. Sukrosa dalam media kultur secara cepat akan diurai menjadi fruktosa dan glukosa. Glukosa adalah yang pertama digunakan oleh sel, diikuti oleh fruktosa. Saat media disterilisasi dengan autoclave, sebagian sukrosa akan mengalami hidrolisa. Apabila sukrosa yang diautoklap ada bersama komponen media lain maka proses hidrolisa akan lebih besar. Kultur dari beberapa spesies tanaman akan tumbuh baik pada media yang sukrosanya diautoklap dibandingkan dengan media yang sukrosanya disterilisasi dengan filter. Hal ini dimungkinkan akan menguntungkan sel-sel karena tersedianya glukosa dan fruktosa. 4. Vitamin Pada beberapa media kultur juga sering ditambahkan vitamin-vitamin seperti biotin, asam folat, asam askorbat, asam panthotenat, vitamin E (tokoperol), riboflavin, dan asam p-aminobenzoik. Meskipun vitamin-vitamin tersebut bukan merupakan faktor pembatas pertumbuhan, tetapi sering memberikan keberhasilan dalam kultur sel dan jaringan tanaman. Biasanya penambahan vitamin-vitamin tersebut ke dalam media dilakukan apabila konsentrasi thiamin dianggap dibawah taraf yang diinginkan atau apabila jumlah populasi sel-sel yang tumbuh masih rendah. 5. Asam Amino dan Sumber Nitrogen Lainnya Sumber nitrogen organik yang paling banyak digunakan dalam media kultur adalah asam amino campuran (casein hidrolisat), L-glutamin, L-asparagin, dan adenin. Casein hidrolisat umumnya digunakan pada konsentrasi antara 0.05- 0.1%. Asam amino biasanya ditambahkan pada media terdiri dari beberapa
  • 67. 67 macam, karena sering diperoleh bahwa penambahan satu jenis asam amino saja justru dapat menghambat pertumbuhan sel. Contoh penambahan asam amino dalam media untuk meningkatkan pertumbuhan sel adalah glisin 2 mg/L, glutamin hingga 8mM, asparagin 100 mg/L, arginin dan sistein 10 mg/L, dan tirosin 100 mg/L. Adenin sulfat juga sering ditambahkan pada media kultur yang fungsinya dapat menstimulir pertumbuhan sel dan meningkatkan pembentukan tunas. 6. Bahan Organik Komplek Arang aktif (activated charcoal) juga sering digunakan pada media kultur. Beberapa hasil penelitian menunjukkan pengaruh yang menguntungkan dan juiga dapat merugikan. Pada kultur beberapa tanaman seperti anggrek, bawang, wortel dan tomat dapat menstimulir pertumbuhan dan diferensiasi, tetapi pada kultur tanaman tembakau, kedelai dan teh justru akan menghambat pertumbuhan. Pengaruh arang aktif umumnya diarahkan pada salah satu dari tiga hal berikut: penyerapan senyawa-senyawa penghambat, penyerapan zat pengatur tumbuh atau menggelapkan warna media. Penghambatan pumbuhan karena kehadiran arang aktif umumnya karena arang aktif dapat menyerap ZPT. NAA, kinetin, BAP, IAA dan 2iP semuanya dapat terikat oleh artang aktif. IAA dan 2iP merupakan ZPT yang paling cepat terikat oleh arang aktif. Arang aktif dapat menstimulasi pertumbuhan sel umumnya karena kemampuan arang aktif mengikat senyawa fenol yang bersifat toksik yang diproduksi biakan selama dalam kultur. Konswentrasi aArang aktif yang ditambahkan kedalam media kultur umumnya sebanyak 0.5-3%. 7. Bahan Pemadat dan Penyangga Biakan Media kultur jaringan tanaman dapat dibuat padat atau semi padat, yaitu dengan penambahan bahan pemadat berupa agar. Dibandingkan bahan pemadat lain, agar mempunyai beberapa keuntungan, yaitu (i) saat dicampur dengan air, agar akan terbentuk bila dilelehkan pada suhu 60o-100oC dan memadat pada suhu 45oC; (ii) gel agar bersifat stabil pada suhu inkubasi; (iii) agar gel tidak bereaksi dengan komponen dalam media dan tidak dicerna oleh ensim tanaman. Kualitas fisik agar dalam media kultur tergantung pada konsentrasi dan merek agar yang
  • 68. 68 diguinakan serta pH media. Konsentrasi agar yang digunakan dalam media kultur berkisar antara 0.5-1%, dengan catatan pH media sesuai dengan aturan. Penggunaan arang aktif (0.8-1%) dapat mempengaruhi kepadatan agar yang terbentuk. Kemurnian agar yang digunakan dalam media kultur juga merupakan faktor yang penting. Agar yang mengandung garam-garam Ca, Mg, K dan Na dapat mempengaruhi ketersediaan hara dalam media. Oleh karena itu penggunaan agar yang murni sangat diperlukan terutama untuk tujuan percobaan. Untuk memurnikan agar dapat dilakukan dengan cara mencuci dengan air destilasi selama 24 jam kemudian dibilas dengan ethanol dan dikeringkan pada suhu 60oC selama 24 jam. Bahan pemadat lain yang pernah dicobakan adalah gelatin pada konsentrasi 10%, akan tetapi terdapat kesulitan karen gelatin meleleh pada suhu 25oC. Methosel dan alginat juga pernah dicobakan sebagai bahan pemadat media, tetapi kedua bahan tersebut sulit penanganannya serta harganya cukup mahal. Bahan lain yang dapat digunakan adalah agarose (konsentrasi 0.35-0.7%), dimana jenis agar ini banyak digunakan pada pekerjaan teknik kultur protoplas. Saat ini bahan pemadat yang banyak digunakan adalah agar sintetik yaitu Phytagel (produk Sigma Chemical) dan Gelrite (produk Kelco Corp.). Agar jenis ini hanya digunakan 2-2.5 g/L dan menghasilkan gel yang bening yang cocok untuk mendeteksi ada tidaknya kontaminan. Gel agar juga berfungsi sebagai penopang agar biakan atau eksplan yang ditanam dalam media tetap pada tempatnya (tidak bergerak atau berpindah). Metoda lain yang dapat digunakan untuk penopang atau penyangga biakan adalah jembatan kerta filter (filter paper bridges), sumbu kertas filter (filter paper wick), busa poliuretran, celophane berlubang dan poliester. Apakah eksplan akan tumbuih lebih baik pada media agar atau dengan penyangga, tergantung dari spesies tanaman yang dikulturkan. 8. Zat Pengatur Tumbuh Terdapat empat klas zat pengatur tumbuh (ZPT) yang penting dalam kultur jaringan tanaman, yaitu: auksin, sitokinin, giberelin dan asam absisik. Skoog dan
  • 69. 69 Miller adalah yang pertama melaporkan bahwa perbandingan auksin dan sitokinin menentukan jenis dan berapa besar proses organogenesis dalam kultur jaringan tanaman. Auksin dan sitokinin yang ditambahkan kedalam media kultur mempunyai tujuan untuk mendapatkan morfogenesis, meskipun perbandingannya untuk mendapatkan induksi akar dan tunas bervariasi baik ditingkat genus, spesies bahkan kultivar. Sitokinin yang ditrambahkan dalam media kultur umumnya ditujukan untuk menstimulasi pembelahan sel, menginduksi pembentukan tunas dan proliferasi tunas aksiler, dan untuk menghambat pembentukan akar. Mekanisme kerja sitokinin tidak secara pasti diketahui, namun demikian beberapa senyawa yang mempunyai aktivitas mirip sitokinin diketahui terlibat dalam transfer-RNA (t-RNA). Sitokinin juga menunjukkan dapat mengaktivasi sintesa RNA dan menstimulasi aktivitas protein dan enzim pada jaringan tertentu. B. Nama- Nama Media Dasar Kultur Jaringan Menurut George dan Sherington (1984) ada media dasar yang pada umumnya diberi nama sesuai dengan nama penemunya, antara lain: 1. Medium dasar Murashige dan Skoog (MS), digunakan hamper pada semua macam tanaman terutama herbaceous. Media ini memiliki konsentrasi garam- garam mineral yang tinggi dan senyawa N dalam bentuk NO3- dan NH4+. 2. Medium dasar B5 atau Gamborg, digunakan untuk kultur suspense sel kedelai, alfafa dan legume lain. 3. Medium dasar white, digunakan untuk kultur akar. Medium ini merupakan medium dasar dengan konsentrasi garam-garam mineral yang rendah. 4. Medium Vacint Went (VW), digunakan khusus untuk medium anggrek. 5. Medium dasar Nitsch dan Nitsch, digunakn untuk kultur tepung sari (Pollen) dan kultur sel. 6. Medium dasar schenk dan Hildebrandt, digunakan untuk tanaman yang berkayu. 7. Medium dasar Woody Plant Medium (WMP), digunakan untuk tanamn yang berkayu.
  • 70. 70 8. Medium dasar N6, digunakan untuk tanaman serealia terutama padi, dan lain- lain. C. Perbandingan Komposisi Media Kultur Jaringan Berikut ini adalah perbandingan komposisi beberapa media kultur jaringan, yaitu diantaranya: 1. Media Murashige & Skoog (media MS) Media MS paling banyak digunakan untuk berbagai tujuan kultur, merupakan perbaikan komposisi media Skoog, Pertama kali unsur-unsur makro dalam media MS dibuat untuk kultur kalus tembakau, tetapi komposisi MS ini sudah umum digunakan untuk kultur jaringan jenis tanaman lain Media MS mengandung 40 mM N dalam bentuk NO3 dan 29 mM N dalam bentuk NH4+. Kandungan N ini, lima kali lebih tinggi dari N total yang terdapat pada media Miller, 15 kali lebih tinggi dari media tembakau Hildebrant, dan 19 kali lebih tinggi dari media White. Kalium juga ditingkatkan sampai 20 mM, sedangkan P, 1.25 mM. Unsur makro lainnya konsemtrasinya dinaikkan sedikit. Pada tahun- tahun sesudah penemuan media MS, dikembangkan media-media lain berdasarkan media MS tersebut, antara lain media : 1. Lin & Staba, menggunakan media dengan setengah dari komposisi unsur makro MS, dan memodifikasi : 9 mM ammonium nitrat yang seharusnya 10mM, sedangkan KH2 PO4 yang dikurangi menjadi 0.5 Mm, tidak 0.625 mM. Larutan senyawa makro dari media Lin & Staba, kemudian digunakan oleh Halperin untuk penelitian embryogenesis kultur jaringan wortel dan juga digunakan oleh Bourgin & Nitsch (1967 dalam Gunawan 1988) serta Nitsch & Nitsch (1969 dalam Gunawan 1988) dalam penelitian kultur anther. Modifikasi media MS yang lain dibuat oleh Durzan et alI (1973 dalam Gunawan 1988) untuk kultur suspensi sel white spruce dengan cara mengurangi konsentrasi K+ dan NO3-, dan menambah konsentrasi Ca2+ nya. 3. Chaturvedi et al (1978) mengubah media MS dengan menurunkan konsentrasi NO3-, K+, Ca2+, Mg2+ dan SO4-2 untuk keperluan kultur pucuk Bougainvillea glabra. 2. Media Schenk & Hildebrant (media SH)
  • 71. 71 Merupakan media yang juga cukup terkenal, untuk kultur kalus tanaman monokotil dan dikotil (Trigiano & Gray, 2000). Konsentrasi ion-ion dalam komposisi media SH sangat mirip dengan komposisi pada media Gamborg dengan perbedaan kecil yaitu level Ca2+, Mg2+, dan PO4-3 yang lebih tinggi. Schenk & Hildebrant mempelajari pertumbuhan jaringan dari 37 jenis tanaman dalam media SH dan mendapatkan bahwa: 32 % dari spesies yang dicobakan, tumbuh dengan sangat baik, 19% baik, 30% sedang, 14% kurang baik, dan 5% buruk pertumbuhannya. Tetapi karena zat tumbuh yang diberikan pada tiap jenis tanaman tersebut berbeda. Media SH ini cukup luas penggunaannya, terutama untuk tanaman legume. 3. Media WPM (Woody Plant Medium) Dikembangkan oleh Lioyd & Mc Coen pada tahun 1981, merupakan media dengan konsentrasi ion yang lebih rendah dari media MS. Media diperuntukkan khusus tanaman berkayu, dan dikembangkan oleh ahli lain, tetapi sulfat yang digunakan lebih tinggi dari sulfat pada media WPM. Saat ini WPM banyak digunakan untuk perbanyakan tanaman hias berperawakan perdu dan pohon-pohon. 4. Media Nitsch & Nitsch Menggunakan NO3- dan K+ dengan kadar yang cukup tinggi untuk mengkulturkan jaringan tanaman artichoke Jerussalem. Penambahan ammonium khlorida sebanyak 0.1 mM, menghasilkan pertumbuhan jaringan yang menurun. Mereka mengambil kesimpulan, bahwa NH4+ sangat menunjang pertumbuhan kalus tembakau (Miller et al, (1956 dalam Gunawan 1988). 5. Media Knop Dapat juga digunakan untuk menumbuhkan kalus wortel. Kultur kalus, biasanya ditumbuhkan pada media dengan kosentrasi garam-garam yang rendah seperti dalam kultur akar dengan penambahan suplemen seperti glucosa, gelatine, thiamine, cysteine-HCl dan IAA (Dodds and Roberts, 1983)
  • 72. 72 6. Media White Dikembangkan oleh Hildebrant untuk keperluan kultur jaringan tumor bunga matahari, ditemukan bahwa unsur makro yang dibutuhkan kultur tersebut, lebih tinggi dari pada yang dibutuhkan oleh kultur tembakau. Unsur F, Ca, Hg dan S, pada media untuk tumor bunga matahari ini, sama dengan media untuk jaringan normal yang dikembangkan kemudian. Konsentrasi NO3- dan K+ yang digunakan Hildebrant ini lebih tinggi dari media white, tetapi masih lebih rendah dari pada media-media lain yang umum digunakan sekarang. 7. Media Knudson dan media Vacin and Went Media ini dikembangkan khusus untuk kultur anggrek. Tanaman yang ditanam di kebun dapat tumbuh dengan baik dengan pemupukan yang hanya mengandung N dari Nitrat. S Knudson pada tahun 1922, menemukan penambahan 7.6 mM NH4+ disamping 8.5 mM NO3-, sangat baik untuk perkencambahan dan pertumbuhan biji anggrek. Penambahan NH4+ ternyata dibutuhkan untuk perkembangan protocorm 8. Media B5(Gamborg) Dalam metode kultur in vitro dikenal beberapa macam jenis media dasar diantaranya media Murashige dan Skoog (MS) dan Gamborg (B5). Media B5 dikembangkan oleh Gamborg et al. pada tahun 1968 untuk kultur suspensi kedelai. Pertama kali dikembangkan untuk kultur kalus kedelai dengan konsentrasi nitrat dan amonium lebih rendah dibandingkan media MS. Untuk selanjutnya media B5 dikembangkan untuk kultur kalus dan suspensi, serta sangat baik sebagai media dasar untuk meregenerasi seluruh bagian tanaman. Pada masa ini media B5 juga digunakan untuk kultur-kultur lain. Media ini dikembangkan dari komposisi PRL-4, menggunakan konsentrasi NH4+ yang rendah, karena konsentrasi yang lebih tinggi dari 2 mM menghambat pertumbuhan sel kedelai. Tetapi peneliti lain melaporkan bahwa konsentrasi NH4+ yang tinggi sampai 20 mM berpengaruh baik dalam kultur jaringan seperti pada kultur kalus tembakau Konsentrasi fosfat yang diberikan pada media tersebut
  • 73. 73 adalah 1mM , Ca+ antara 1-4 mM, dan Mg antara 0,5-4 mM lebih mengutamakan kandungan ammonium dibandingkan media MS. Meskipun media B5 pada awalnya digunakan untuk menginduksi kalus atau diutamakan sebagai kultur suspensi, tetapi dapat digunakan pula sebagai media dasar bagi perbanyakan tanaman pada umumnya. Gamborg (1991) menyatakan bahwa kadar hara anorganik yang dikandung media dasar Gamborg (B5) umumnya lebih rendah dari pada media dasar MS. Hal tersebut sering kali lebih baik bagi sel spesies tertentu. Untuk selanjutnya media B5 dikembangkan untuk kultur kalus dan suspensi, serta sangat baik sebagai media dasar untuk meregenerasi seluruh bagian tanaman. d. Teknik Kultur Jaringan Teknik kultur jaringan dapat dilaksanakan dengan dua metode yaitu: Metode Padat (Solid Method) Metode pada dilakukan dengan tujuan mendapatkan kalus dan kemudian dengan medium diferensiasi yang berguna untuk menumbuhkan akar dan tunas sehingga kalus dapat tumbuh menjadi planlet. Media padat adalah media yang mengandung semua komponen kimia yang dibutuhkan oleh tanaman dan kemudian dipadatkan dengan menambahkan zat pemadat. Zat pemadat tersebut dapat berupa agar-agar batangan, agar-agar bubuk, atau agar-agar kemasan kaleng yang yang memang khusus digunakan untuk media padat untuk kultur jaringan. Media yang terlalu padat akan mengakibatkan akar sukar tumbuh, sebab akar sulit untuk menembus ke dalam media. Sedangkan media yang terlalu lembek akan menyebabkan kegagalan dalam pekerjaan. Kegagalan dapat berupa tenggelamnya eksplan yang ditanam. Eksplan yang tenggelam tidak akan dapat tumbuh menjadi kalus, karena tempat area kalus yaitu pada irisan (jaringan yang luka) tertutup oleh medium. Metode padat dapat digunakan untuk metode kloning, untuk menumbuhkan protoplas stelah diisolasikan, untuk menumbuhkan planlet dari protokormus stelah dipindahkan dari suspensi sel, dan untuk menumbuhkan planlet dari prtoplas yang sudah difusikan (digabungkan).
  • 74. 74 Metode Cair(Liquid Method) Penggunaan metode cair ini kurang praktis dibandingkan dengan metode padat, karena untuk menumbuhkan kalus langsung dari ekspaln sangat sulit sehingga keberhasilannya sangat kecil dan hana tanaman-tanaman tertentu yang dapat berhasil. Oleh karena itu, penggunaan media cair lebih ditekankan untuk suspensi sel, yaitu untuk menumbuhkan plb (prtocorm like bodies). Dari protokormus ini nantinya dapat tumbuh menjadi planlet apabila dipindahkan kedalam media padat yang sesuai. Pembuatan media cair jauh lebih cepat daripada media padat, karena kita tidak perlu memanaskannya untuk melarutkan agar-agar. Media cair juga tidak memerlukan zat pemadat sehingga keadaannya tetap berupa larutan nutrein. e. Pembuatan Media Kultur Jaringan Tahun 1962 Murashige dan Skoog memperkenalkan hasil temuannya berupa komposisi media kultur yang terdiri dari unsur makro, unsur mikro, vitamin dan asam amino pada konsentrasi tertentu. Temuan ini dikenal dengan nama media Murashige dan Skoog (MS). Media MS (Murashige dan Skoog) merupakan media universal yang paling umum digunakan pada kegiatan kultur jaringan tanaman. Media MS yang dibuat mengandung nutrisi makro anorganik, nutrisi mikro anorganik, nutrisi Fe, vitamin, organik dan zat pengatur tumbuh tanaman (phytohormon). Komposisi nutrisi makro yang digunakan adalah: KNO3, NH4NO3, CaCl2.H2O, MgSO4.7H2O, KH2PO4 Komposisi ini mengandung : N (KNO3 dan NH4NO3); K (KNO3 dan KH2PO4); P ( KH2PO4), Ca (CaCl2.H2O); Mg (MgSO4.7H2O) dan S ( MgSO4.7H2O) unsur kimia ke dalam pertumbuhan tanaman. Unsur nitrogen ditambahkan dalam jumlah besar dibandingkan dengan unsur yang lain karena tanaman membutuhkan nutrisi tersebut dalam jumlah besar untuk pertumbuhan vegetatif (Prakash et al, 2004). Nutrisi mikro yang digunakan dalam praktikum kali ini dalam bentuk nutrisi stok B yaitu MnSO4.4H2O, ZnSO4.4H2O, H3BO3 and KI. Nutrisi mikro dalam kultur jaringan tanaman menggunakan konsentrasi molar yaitu Fe, Mn, Zn,
  • 75. 75 B, Cu dan Mo. Fe dapat diperoleh dari larutan stok C karena unsur ini sangat reaktif dengan unsur lain dan cahaya. Vitamin dibutuhkan untuk pertumbuhan dan pengembangan untuk tanaman sintesis seperti karbohidrat dan asam nukleat. Thiamin semestinya harus digunakan dalam pembuatan stok vitamin atau disebut juga larutan stok D. Komponen ini diperlukan pada konsentrasi yang sangat rendah. Phytohormon yang digunakan adalah kinetin dengan rasio 1: 1. Rasio pada phytohormon determinen untuk divisi sel dan formasi kulit yang tebal dan keras. Membuat larutan stok harus dilarutkan kinetin dengan NaOH (untuk IAA) dan HCl (untuk kinetin). Agar dan gula diperlukan untuk pembuatan media. Bubuk agar perlu untuk media pembuatan menjadi semi padat. Diperlukan pemanas untuk mencairkan bubuk agar dan media MS cair sampai mendidih. Gula berfungsi ganda di dalam media yaitu berfungsi sebagai sumber energi dan sebagai penyeimbang tekanan osmotik media. Menurut George & Sherrington (1984) dalam Anonim (2009), 4/5 bagian dari potensial osmotik dalam media White disebabkan oleh gula, sedangkan dalam media MS hanya 1/2 dari potensial osmotiknya disebabkan adanya gula. Sebelum media dipanaskan harus diperiksa pH nya terlebih dahulu. Media sangat baik pada pH 5,8 jika pH kurang dari 5 media agar akan terlalu lemah, tetapi jika pH di atas 7 media agar terlalu padat dan tidak bisa penanaman eksplan dengan baik. Faktor penting adalah pH yang harus diatur sedemikian rupa sehingga tidak mengganggu fungsi membran sel dan pH dari sitoplasma. Pengaturan pH selain memperhatikan kepentingan fisiologi sel, juga harus mempertimbangkan faktor-faktor (Anonim, 2009): 4. Kelarutan dari garam-garam penyusun media 5. Pengambilan (uptake) dari zat pengatur tumbuh dan garam-garam lain 6. Efisiensi pembekuan agar. Untuk menghindarkan perubahan pH yang cukup besar. Murashige dan Skoog menyarankan agar dilakukan pemanasan untuk melarutkan agar-agar dan memanaskan media di dalam autoklaf selama beberapa menit, baru diadakan penetapan media disterilkan dalam autoklaf. Dalam wadah yang besar, media
  • 76. 76 disterilkan dan kemudian dititrasi dengan NaOH/HCl steril sampai pH yang diinginkan. Setelah itu media dituang ke dalam wadah kultur steril yang telah dipersiapkan di dalam Laminar Air Flow cabinet. Keuntungan dari pemakaian agar adalah (Anonim, 2009): 1. Agar membeku pada temperatur ≤ 45o C dan mencair pada temperatur 100o C, sehingga dalam kisaran temperatur kultur, agar akan berada dalam keadaan beku yang stabil. 2. Tidak dicerna oleh enzim yang dihasilkan oleh jaringan tanaman. 3. Tidak bereaksi dengan persenyawaan-persenyawaan penyusun media. Setiap jenis vitamin mempunyai fungsi yang berbeda-beda di dalam tubuh tanaman antara lain: 1. Inositol (vit. B) bagian dari berbagai macam membran (kloroplas). 2. Thyamin (vit. B1) berperan sebagai ko-enzim dari siklus krebs. 3. Nicotinic acid (niacin) berperan dalam fotosintesa. 4. Pyridoxine (vit. B6) berperan sebagai ko-enzim pada beberapa enzim. 5. Pantothenic acid (a vit. B) berperan sebagai ko-enzim dalam metabolisme lemak. 6. Riboflavin (vit. B12) berperan sebagai ko-enzim reseptor sinar biru. 7. Biotin (vit. H) berperan sebagai ko-enzim dalam metabolisme lemak. Hormon yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah kinetin golongan dari sitokinin. Golongan sitokinin adalah turunan dari adenine. Golongan ini sangat penting dalam pengaturan pembelahan sel dan morfogenesis. Kinetin merupakan sitokinin yang pertama ditemukan dan diisolasi oleh Skoog dalam laboratorium Botani di University of Wisconsin. Kinetin diperoleh dari DNA ikan Herring yang diautoklaf dalam larutan yang asam. Persenyawaan dari DNA tersebut sewaktu ditambahkan ke dalam media untuk tembakau, ternyata merangsang pembelahan sel dan differensiasi sel. Persenyawaan tersebut kemudian dinamakan kinetin.
  • 77. 77 Fungsi sitokinin terhadap tanaman antara lain: 1. Memacu terbentuknya organogenesis dan morfogenesis. 2. Memacu terjadinya pembelahan sel. 3. Kombinasi antara auksin dan sitokinin akan memacu pertumbuhan kalus. Penyesuaian tanaman pada media kultur diharapkan mampu mempertahankan pertumbuhan sel tanaman dan mendorong pembelahan sel. Tanaman dapat bertahan hidup dan melanjutkan perkembangannya harus dipenuhi dengan media yang tepat serta media yang bebas dari penyakit. Media dapat bebas dari penyakit dan kontaminasi mikroba perlu disterilisasi terlebih dahulu. Alat sterilisasi yang biasa digunakan dalam kultur jaringan yaitu autoklaf. Berikut adalah langkah-langkah sterilisasi media. 1. Mengisi panci luar autoklaf dengan air, kalau dapat dengan aquadest untuk menghindarkan pengendapan Ca yang biasa terdapat pada air ledeng sebanyak 1 liter untuk autoklaf kecil dan 1.5 liter untuk autoklaf besar. 2. Botol-botol yang telah diisi media yang akan disterilisasi di masukkan ke dalam panel dalam. Susun botol-botol tersebut hingga mencapai permukaan panel. 3. Atur posisi panci dengan memperhatikan alur tempat saluran uap yang terdapat pada tutup dan lingkaran permukaan panci luar 4. Tutup dengan erat. (kencangkan pengunci tanpa menggunakan alat) 5. Biarkan salah satu katup pengeluaran uap dalam keadaan terbuka. 6. Letakkan autoklaf di atas kompor gas atau pembakar Bunsen. 7. Panaskan sampai air dalam autoklaf mendidih dan uap mulai keluar dari katup pengeluaran uap. 8. Biarkan uap keluar selama 5 menit (minimum), untuk mengeluarkan udara mengeluarkan udara yang terperangkap dalam autoclave. 9. Tutup katup pengeluaran uap. 10. Amati kenaikan temperature dan tekanan. 11. Setelah tekanan mencapai 15 psi dengan suhu 121oC, api kompor dikecilkan. 12. Jaga keadaan tekanan 15 psi ini dengan mengatur besar kecilnya api kompor secara manual. Sampai pada suhu 126 oC matikan api kompor. Selama sterilisasi jangan meninggalkan autoklaf dan mengerjakan hal lain diruang lain karena
  • 78. 78 tekanan dapat meningkat sampai melewati batas. Keadaan ini berbahaya dan dapat menyebabkan kerusakan alat. 13. Uap dikeluarkan sedikit-sedikit dengan mengatur katup pengeluaran uap (buka sedikit-sedikit). Jangan sekali-kali membuka katup dan membiarkan uap keluar sekaligus. Keadaan ini menyebabkan media atau air bubble up 14. Setelah tekanan turun sampai 0, buka pengunci dan keluarkan panci yang berisi media. 2.12. Contoh Penerapan Kultur Jaringan Contoh pembuatan perbanyakan tanaman Pulai Pandak (Rauwolfia serpentina L.) dengan teknik kultur jaringan: Rauwolfia serpentina, salah satu anggota famili Apocynaceae yang merupakan tumbuhan obat potensial untuk dikembangkan, karena disamping dibutuhkan sebagai bahan baku obat tradisional juga digunakan sebagai bahan untuk fitofarmaka. Tumbuhan ini banyak diminati oleh negara-negara industri farmasi dan merupakan spesies tumbuhan yang mempunyai pasaran baik di Amerika Sertikat, Jepang, Jerman, Prancis, Swiss dan Inggris, karena R. serpentina mengandung beberapa senyawa diantaranya reserpin, rescinamine dan ajmalin yang digunakan sebagai obat penurun tekanan darah tinggi, tranquilizer (penenang) dan gangguan pada sistem sirkulator. Senyawa-senyawa ini belum dapat dibuat sintetisnya meskipun struktur kimianya telah diketahui (Prasetyorini 2000). R serpentina merupakan salah satu jenis tanaman yang sudah dinyatakan langka dan sudah terancam punah. Simplisianya diperoleh dengan cara pengumpulan langsung dari alam (hutan) oleh karena permintaan yang cukup tinggi mengakibatkan pemanenan berlebihan, sehingga mengancam kelestariannya (Zuhud et al. 1994 dalam Yahya 2001). Faktor lain penyebab kelangkaan R serpentina adalah bagian yang di manfaatkan sebagai bahan obat adalah akar, tanaman ini sulit di perbanyak secara konvensional dan penyebarannya terbatas. Oleh karena itu perlu segera dilakukan upaya pengembangannya. Salah satu faktor yang menentukan keberhasilan pengembangan suatu jenis tanaman adalah ketersediaan bibit bermutu.
  • 79. 79 Penyediaan bibit melalui perbanyakan tanaman secara konvensional kurang memadai, seperti yang dilaporkan oleh Sudiarto et al. (1985), perbanyakan R serpentina secara konvensional menunjukkan bahwa pertumbuhan biji dan stek batang kurang dari 15%. Persentase tumbuh yang rendah di sebabkan biji bertempurung keras, sehingga daya kecambah juga sangat rendah. Salah satu teknologi yang biasa digunakan dan memberikan harapan dalam penyediaan bibit dalam jumlah besar dan waktu relatif lebih singkat adalah teknik kultur in vitro. Telah banyak tanaman yang berhasil di perbanyak dengan teknik kultur jaringan ini (in vitro) di antaranya yaitu Tebu (Saccharum officinarumL.) (Behera et al. 2009), Pisang (Lee 2010), dan phalenopsis (Kosir et al. 2004) Perbanyakan secara in vitro dapat dilakukan melalui tiga cara yaitu pembentukan tunas adventif, proliferasi tunas lateral, dan embriogenesis somatik. Penelitian perbanyakan tanaman R serpentina melalui proliferasi tunas telah dilakukan oleh Lestari dan Mariska (2011), dimana tunas apikal dan internodus yang dikulturkan pada media MS+BAP 0,8mg/l memberikan nilai multiplikasi tunas yang lebih tinggi media terbaik untuk induksi perakaran adalah MS+IBA 0,8 mg/l. Perbanyakan R serpentina melalui embriogenesis somatik juga mampu memperbanyak bibit dalam jumalah yang relatif besar (Singh et al. 2009). Akan tetapi dengan cara ini kemungkinan akan terjadi variasi somaklonal sehingga bibit yang dihasilkan tidak sama dengan induknya ( Hutami et al. 2006). Pada penelitian ini dilakukan induksi tunas langsung dari daun atau ruas batang untuk mendapatkan tunas yang banyak akan tetapi tidak mengalami perubahan pada sifat genetiknya sehingga bibit yang di hasilkan sama dengan induknya. Induksi tunas adventif dari eksplan ruas batang dan daun secara in vitro, sejauh ini belum banyak dilaporkan. Pada penelitian ini telah lakukan induksi dan multiplikasi tunas ruas batang dan daun serta induksi perakarannya. Tujuan dari penelitian ini adalah (1) Untuk mendapatkan jenis eksplan dan formulasi media yang temapat untuk induksi tunas (2) Mendapatkan formulasi media yang tepat untuk multiplikasi tunas (3) Mendapatkan Formulasi media yang tepat untuk induksi perakaran secara in vitro dan (4) mendapatkan media tanam yang tepat untuk aklimatisasi.
  • 80. 80 Bahan dan Metode: Bahan tanaman yang digunakan adalah biakan in vitro R serpentina (L.) koleksi BB-Biogen Tahapan penelitian ini terdiri atas empat kegiatan yaitu (1) penyedian bahan eksplant (2) regenerasi tunas (3) Multiplikasi tunas (4) Induksi perakaran dan (5) aklimatisasi plantlet (1) Penyediaan bahan eksplant. Biakan in vitro R serpentina (L.) koleksi BB-biogen, disubkultur pada media dasar MS dengan penambahan ZPT BAP 0,1mg/l untuk penyediaan eksplan. Media dasar yang digunakan adalah MS (Murashige & Skoog 1962), yang diperkaya dengan vitamin dan dilengkapi dengan sukrosa 3% (w/v), serta dibuat padat dengan menambahkan agar 0,2% (phytagel/Gelrate). Selanjutnya pH media dibuat 5,8 dengan menambahkan 1N NaOH atau 1N HCl sebelum di autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit. Biakan di letakkan pada ruang kultur pada suhu 25 ± 20C dengan intensitas penyinaran sebesar 1.000–2.000lux selama 16 jam. Setelah biakan berumur 2 bulan, setinggi ±5cm dan menghasilkan daun yang memiliki ukuran yang memadai sebagai eksplan (Gambar 1a), maka biakan siap dijadikan eksplan untuk regenerasi tunas. Bagian tanaman yang digunakan sebagai eksplan untuk regenerasi tunas adalah daun dan batang. Daun dipotong segi empat dengan ukuran ± 0,7cm x 0,7 cm (Gambar 1 b) dan batang yang digunakan ialah internodul panjang ± 0,7 cm dan bagian nodul dibuang (Gambar 1c). (2) Induksi tunas tunas. Pada kegiatan induksi tunas ini mengunakan eksplan daun dan ruas batang dari hasil kegitan 1. media yang di gunakan adalah media dasar MS yang diperkaya dengan ZPT yaitu BAP pada konsentrasi 0,0; 0,1; 0,3, mg/l dikombinasikan dengan 2ip pada konsentrasi 0, 1, 2 mg/l. Masing perlakuan terdiri atas 30 ulangan. Peubah yang diamati adalah persentase eksplan membentuk tunas, jumlah dan tinggi tunas yang terbentuk. (3) Multiplikasi tunas. Tunas yang dihasilkan pada kegiatan 2 dipindahkan ke media multiplikasi. Media untuk multuplikasi adalah media dasar MS yang diperkaya dengan BAP pada tingkatan konsentrasi 0,0; 0,5; 1mg/l dan di kombinasikan dengan Thidiazuron pada beberapa konsntrasi yaitu 0,0; 0,1; 0,2
  • 81. 81 dan 0,3 mg/l. Masing-masing perlakuan terdiri atas 30 ulangan. Peubah yang diamati meliputi jumlah tunas dan penampakan visualnya. (a) (b) Gambar 2 (a) Tunas yang terbentuk dari ekplan batang (b) Tunas yang terbentuk dari eksplan daun. (a) (b) (c) Gambar 1 (a) biakan R serpentina in vitro yang digunakan sebagai eksplan untuk induksi kalus, (b) batang dan (c) daun
  • 82. 82 (4) Induksi perakaran. Tunas yang tingginya ± 5 cm, dipindahkan pada media perakaran. Percobaan perakaran menggunakan media MS yang diperkaya dengan auksin IBA pada beberapa tingkatan konsentarasi yaitu 0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 mg/l. Masing–masing perlakuan terdiri atas 30 ulangan. Peubah yang diamati adalah jumlah akar dan panjang akar setelah berumur 8 minggu. (5) Aklimatisasi plantlet. Planlet yang memiliki akar yang telah terbentuk sempurna selanjutnya diaklimatisasi. Aklimatisasi dilakukan dengan cara biakan dikeluarkan dari botol. Biakan selanjutnya ditanam pada media yang telah disiapkan. Media tanam yang digunakan sebagai perlakuan adalah adalah (1) Kompos, (2) tanah, (3) Kompos+pasir (perbandingan 1:1) (4) Tanah+pasir (perbandingan 1:1) (5) Tanah+kompos (6) Tanah+kompos+pasir (perbandingan 1: 1: 1). Masing-masing perlakuan terdiri atas 20 ulangan. Parameter yang diamati adalah persentase tanaman yang hidup setelah diaklimatisasi. Hasil: a. Induksi tunas. Hasil percobaan menunjukkan bahwa pada umumnya eksplan yang berasal dari batang mampu membentuk tunas kecuali pada perlakuan 0,1 mg/l BAP+1 mg/l 2ip eksplan yang menghasilkan tunas hanya 60%. Untuk eksplan yang berasal dari daun, persentase eksplan yang terbentuk relatif rebih rendah. Bahkan untuk perlakuan 1 mg/l 2ip, 2 mg/l 2ip dan 0,1 mg/l BAP+2 mg/l 2iP tidak mampu memacu terbentuknya tunas. Pemberian 0,1 mg/l BAP dan 0,3 mg/l BA pada eksplan daun mampu menginduksi terbentuknya tunas hingga 80% sedangkan pada perlakuan 0,3 mg/l BAP + 1 mg/l 2iP dan 0,3 mg/l BAP + 2 mg/l 2iP persentase eksplan daun yang menghasilkan tunas adalah 100% (Tabel 1). Jika dilihat pada Tabel 2, penambahan zat pengatur tumbuh (ZPT) 0,1 mg/l BAP pada media, mampu menginduksi terbentuknya tunas dari ekplan batang rata-rata jumlah tunas yang dihasilkan sebanyak 1,4 dan ekplan daun rata- rata jumlah tunas yang dihasilkan sebanyak 1,2. Bila konsentrasi BAP ditingkatkan hingga 0,3 mg/l, maka rataan jumlah tunas yang dihasikan oleh ekplan batang maupun daun juga meningkat yaitu menjadi 1,6 dan 3,6 tunas. Hal yang sama juga terjadi pada tanaman melon (Cucumis melo) peningkatan
  • 83. 83 konsentrasi BAP yang diberikan mampu meningkatkan kemampuan ekplan bertunas (Rohayati 2003). Begitu pula dengan rataan tinggi tanaman, peningkatan konsentrasi BAP yang diberikan hingga 0,3 mg/l cenderung meningkatkan tinggi tanaman. Pemberian 1 mg/l dan 2mg /l 2ip pada eksplan daun mampu menginduksi terbentuknya tunas 1,2 dan 1,4, sedangkan pada eksplan batang tidak mampu menginduksi terbentuknya tunas. 2ip merupakan ZPT yang tergolong kedalam sitokinin yang berperan sebagai promotor dalam pembentukan jaringan. Eksplan daun dan batang yang di tumbuhkan pada media MS yang dikombinasikan dengan 0,3 mg/l BAP dari 2 mg/l 2iP memberikan rataan jumlah tunas yang lebih tinggi dari pada perlakaun lainnya yaitu 2,4 dan 7 (Tabel 2). Biakan yang di kulturkan pada media kombinasi BAP dan 2ip cendrung menghasilkan tunas yang lebih tinggi daripada perlakuan tunggal. Hal ini karena ada sifat sinergis dari kedua jenis sitokin tersebut dalam proses pembelahan dan pembesaran sel. b. Multiplikasi tunas Tunas yang terbentuk disubkultur kemedia multiplikasi yaitu media MS+0,1 mg/l BA. Tunas yang disubkultur berukuran + 1 cm yang mengandung 2 nodus. Tabel 1 Persentase Pembentukan tunas pada formulasi media dan jenis eksplan yang beda pada minggu ke-10 setelah masa tanam
  • 84. 84 Tabel 2 Pengaruh formulasi media terhadap pertumbuhan biakan minggu ke – 8 Pada Tabel 3, terlihat bahwa pemberian Thidiazuron secara tunggal mampu meningkatkan kemampuan tunas untuk bermultiplikasi. Peningkatan konsentrasi Thidiazuron hingga 0,3 mg/l mampu meningkatkan jumlah tunas hingga 4,6 Tunas. Penggunaan BAP secara tunggal pada konsentrasi 0,5 dan 1 mg/l belum mampu meningkatkan kemampuan tunas bermultiplikasi seperti pada pemberian Thidiazuron secara tunggal. Keadaan yang sama juga terjadi pada taman melinjo (Gnetum gnemon) dimana pemberian Thidiazuron hingga 0,3 mg/l mampu meningkatkan kemampuan tunas untuk bermultiplikasi (Yunita 2004). Hal yang sama juga di temui pada tanaman Plumbago zeylanica L bahwa pemberian Thidiazuron hingga 0,05 mg/l mampu meningkatkan kempuan tunas untuk bermultiplikasi. Hal ini karena Thidiazuron memiliki kempuan untuk menginduksi terjadinya proses pembelahan sel (Syahid & Kristina 2008). Penggunan BAP dan thidiazuron secara bersamaan mampu menigkatkan kemampuan tunas bermultiplikasi daripada pemberian BAP atau Thidiazuron secara tunggal. Pada percobaan ini pemberian BAP dan thidiazuron yang optimum adalah pada konsentrasi 0,5 mg/l BAP dan 0,2 mg/l Thidiazuron dimana rerata tunas yang dihasilkan adalah 7,7 tunas. Pengunaan thidiazuron pada konsentrasi rendah akan lebih efektif apabila dikombinasi dengan BA, akan tetapi peningkatan konsentrasi BAP dan Thidiazuron cenderung menurunkan kemampuan tunas untuk bermultiplikasi, hal ini juga terjadi pada tanaman Kigelia pinnata dimana kemampuan multiplikasinya meningkat bila diberi Thidiazuron hinga 0,5 μM dan bila kosentrasi terus ditingkatkan maka kemampuan tunas untuk bermultiplikasi menjadi menurun (Thomas & Puthur 2004).
  • 85. 85 Tabel 3 Pengaruh formulasi media multiplikasi terhadap rerata jumlahtunas pada umur biakan minggu ke – 8 Tabel 4 Pengaruh konsentrasi IBA terhadap rerata jumlah akar danrerata panjang akar umur biakan minggu ke – 8 Gambar 3 Tunas yang di multiplikasi pada media MS + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l Thi
  • 86. 86 Gambar 4 Akar yang dihasilkan pada media MS + 1 mg/l IBA c. Induksi perakaran. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemberian IBA secara umum mampu menginduksi pembentukan akar pada tunas in vitro. Dari Tabel 4, terlihat bahwa pemberian IBA yang terbaik untuk induksi perakaran adalah pada konsentrasi 1,0 mg/l. Pada konsentrasi tersebut mampu menghasilkan akar lebih banyak dengan nilai rataan 4,8 dan rataan panjang akar 2,6 cm. Peningkatan konsentrasi IBA lebih dari 1mg/l menurunkan kemampun tunas untuk membentuk akar di samping itu akar yang dihasilkan lebih pendek. Menurut Davies (1993), Penambahan auksin pada konsentrasi tertentu pada media biakan mampu menginduksi pembentukan akar, Tetapi bila konsentrasi yang diberikan terlalu tinggi akan menghambat pembentukan akar tersebut. Penambahan auksin eksogen dalam konsentrasi tinggi pada media biakan akan menstimulasi diferensiasi jaringan pembuluh yang cepat, sehingga akan meningkatkan jumlah dan ukuran jaringan tersebut. IBA merupakan ZPT jenis auksin yang umum digunakan untuk menginduksi perakaran tanaman secara in vitro. Pada tanaman sukun dalam waktu dua bulan eksplan yang ditanam pada WPM+3 mg/l IBA mampu membentuk akar dengan persentase perakaran 60% dan panjang akar 4,5 cm (Mariska et al. 2004). Pada tanaman Belimbing dewi tunas in vitro yang ditanam pada media ½ WPM+3 mg/l IBA persentase tunas
  • 87. 87 yang berakar 80% dengan rata rata jumlah akar 7,0 buah dan rerata panjang akar 4,2 cm (Suryati et al. 2004). Tabel 5 Persentase tanaman yang hidup setelah berumur 7 minggusetelah aklimatisasi d. Aklimatisasi tunas Aklimatisasi adalah suatu aktifitas atau kegiatan pemindahan tanaman dari lingkungan yang terkendali (in vitro) ke lingkungan mandiri (eks vitro). Planlet yang pertumbuhannya telah optimal dan memiliki perakaran sempurna dilakuan uji aklimatisasi pada berbagai media tumbuh. Pada Tabel 5, dapat dilihat bahwa kemampuan planlet untuk tumbuh berkisar dari 25-80%, kemampuan tumbuh tertinggi yaitu 80%, Pada perlakuan kompos+tanah (perbandingan 1:1). Dengan mengunakan media kompos saja dan tanah saja kemampuan tumbuh tanaman sangat rendah yaitu 25%. Media aklimatisasi yang tepat untuk masing-masing tanaman hasil kultur jaringan berbeda-beda. Semua planlet yang diaklimatisasi disungkup dengan gelas aqua plastik dengan tujuan untuk menciptakan tingkat kelembaban yang diinginkan. Kelembaban yang tinggi umumnya diperlukan bagi hampir semua tanaman yang berasal dari kultur jaringan karena lapisan kultikula pada daun masih tipis. Stomata belum berfungsi secara normal, serta hubungan jaringan pembuluh akar dan batang belum sempurna. Simpulan Dari penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa eksplan terbaik untuk induksi kalus adalah ruas batang in vitro yang dikulturkan pada media dasar MS + 0,3 mg/l BAP+1 mg/l 2iP. Formulasi media terbaik untuk multiplikasi tunas adalah MS + 0,5 mg/l BAP + 0,1 mg/l Thidiazuron. Sedangkan untuk induksi perakaran formulasi media terbaik adalah MS+1 mg/l IBA. Pada tahap aklimatisasi, media tanaman optimum yang di gunakan untuk proses ini
  • 88. 88 adalah campuran Kompos + tanah dengan perbandingan 1:1. Tabel 5 Persentase tanaman yang hidup setelah berumur 7 minggu setelah aklimatisasi. 2.13.Kultur Jaringan pada Hewan Kultur jaringan pada hewan jarang dilakukan karena adanya pro-kontra dalam masyarakat. 1. Pengertian Kloning Kloning berasal dari kata ‘Clone” yang diturunkan dari bahasa Yunani “Klon” yang artinya potongan yang digunakan untuk memperbanyak tanaman. Kloning adalah langkah penggandaan (pembuatan tiruan yang sama persis) dari suatu makhluk hidup dengan menggunakan kode DNA makhluk tersebut. Kloning dalam biologi adalah proses menghasilkan individu-individu dari jenisyang sama (populasi) yang identik secara genetik 2. Sejarah Kloning. Kloning sebagai prosedur perbanyakan non-seksual telah sukses dilakukan sejak tahun 1952 oleh Briggs dan King, dan disempurnakan di Oxford oleh Sir John Gurdontahun 1962-1966. Kloning dapat berupa klon sel, yaitu sekelompok sel yang identik sifat- sifat genetiknya, semua berasal dari satu sel, dan klon gen atau molecular, yaitu sekelompok salinan gen yang bersifat identik yang direplikasi dari satu gen yang dimasukkan ke dalam sel inang.  Kloning sel Kloning sel adalah teknik untuk menghasilkan salinan makhluk hidup dengan menggunakan bahan genetis dari sel makhluk itu sendiri. 1997 Dr Ian Wilmut dan rekannya dari Institute Roslin di Edinburgh, Inggris, mengklon domba dari sel epitel ambing (sel payudara) seekor domba lainnya.Wilmut pertama mengambil sel epitel ambing seekor domba jenis Finn Dorset berumur enam tahun yang sedang hamil. Kemudian sel ambing itu dikultur dalam cawan petri dengan sumber makanan yang terbatas. Karena
  • 89. 89 kelaparan sel itu berhenti berkembang atau mematikan aktivitas gennya.Sementara itu mereka juga mengambil sel telur yang belum dibuahi dari seekor domba betina jenis Blackface. Inti sel telur yang bisa membelah menjadi domba dewasa setelah dibuahi itu kemudian diambil, sekarang sel telur itu kosong, hanya berisi organela dan plasma sel saja. Selanjutnya dua sel itu didekatkan satu dengan lainya. Kejutan aliran listrik membuat kedua sel itu bergabung seperti dua gelembung sabun. Kejutan aliran listrik kedua meniru energi alami yang muncul ketika telur dibuahi oleh sperma, sehingga sel telur dengan inti baru itu merasa telah dibuahi. Kejutan aliran listrik itu telah mengubah sel telur dengan inti baru itu seakan-akan menjadi sel embrio. Kurang lebih enam hari kemudian, sel embrio bohongan itu disuntikkan ke dalam rahim seekor domba betina Blackface lainnya yang kemudian mengandung. Setelah mengandung selama 148 hari induk domba titipan ini melahirkan Dolly, seekor domba lucu seberat 6,6 kilogram yang secara genetis persis dengan domba jenis Finn Dorset pemilik inti sel ambing.  Sel Eukariotik Secara taksonomi eukariotik dikelompokkan menjadi empat kingdom, masing-masing hewan (animalia), tumbuhan (plantae), jamur (fungi), dan protista, yang terdiri atas alga dan protozoa. Salah satu ciri sel eukariotik adalah adanya organel-organel subseluler dengan fungsi-fungsi metabolisme yang telah terspesialisasi. Tiap organel ini terbungkus dalam suatu membran. Sel eukariotik pada umumnya lebih besar daripada sel prokariotik. Diameternya berkisar dari 10 hingga 100 µm. Seperti halnya sel prokariotik, sel eukariotik diselimuti oleh membran plasma. Pada tumbuhan dan kebanyakan fungi serta protista terdapat juga dinding sel yang kuat di sebelah luar membran plasma. Di dalam sitoplasma sel eukariotik selain terdapat organel dan ribosom, juga dijumpai adanya serabut- serabut protein yang disebut sitoskeleton. Serabut-serabut yang terutama berfungsi untuk mengatur bentuk dan pergerakan sel ini terdiri atas mikrotubul (tersusun dari tubulin) dan mikrofilamen (tersusun dari aktin).
  • 90. 90 3. Jenis-Jenis Kloning Dikenal 3 jenis kloning biologi : 1. Kloning tingkat DNA Kloning dilakukan terhadap untaian DNA untuk mendapatkan untaian DNA yang identik, yang kemudian menggunakan plasmid bakteri menghasilkan molekul dengan sifat genetik yang sama untuk kepentingan pembuatan monoklonal, antibody untuk keperluan diagnostik,pembuatan vaksin dsb. 2. Kloning untuk upaya terapi Kloning ditujukan untuk menghasilkan sitem cell (sel punca).Sitem cell ini di”panen” dari kloning yang menghasilkan embrio manusia, namun tidak dikembangkan menjadi mahluk baru. 3. Kloning untuk Reproduksi Merupakan hal yang sangat menggelitik bagipara ilmuwan untuk “menciptakan” machluk menggunakan teknologi kloning.Sel telur matang yang dibuang inti selnya, ke dalamnya kemudian disuntikkan inti sel somatik,sehingga sel yang kemudian terbentuk diupayakan untuk tumbuh kembang menghasilkan mahluk baru. Hal ini serupa dengan reproduksi vegetatif, tanpa melalui proses pembuahan sel telur oleh benih laki-laki 4. Macam-Macam Kloning  Kloning Pada Tumbuhan Nama lain dari kloning pada tumbuhan adalah kultur jaringan, yaitu suatu teknik untuk mengisolasi, sel, protoplasma, jaringan, dan organ dan menumbuhkan bagian tersebut pada nutrisi yang mengandung zat pengatur tumbuh tanaman pada kondisi aseptik,sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman sempurna kembali. Ada dua teori dasar yang berpengaruh dalam kultur jaringan. Yang pertama adalah teori bahwa sel dari suatu organisme multiseluler di mana pun
  • 91. 91 letaknya, sebenarnya sama dengan sel zigot karena berasal dari satu sel tersebut. Yang kedua adalah teori totipotensi sel atau Total Genetic Potential. Artinya, setiap sel yang memiliki potensi genetik mampu memperbanyak diri dan berdiferensiasi menjadi suatu tanaman lengkap. Dalam kultur jaringan ada beberapa factor yang mempengaruhi regenerasi tumbuhannya, yaitu :  Bentuk regenerasi dalam kultur in vitro, seperti pucuk adventif atau embrio somatiknya  Eksplan, yaitu bagian tanaman yang digunakan sebagai bahan awal untuk perbanyakan tanaman. Yang penting dalam eksplan ini adalah factor varietas, umur, dan jenis kelaminnya. Bagian yang sering menjadi ekspan adalah pucuk muda, kotiledon, embrio, dan sebagainya.  Media tumbuh, karena di dalam media tumbuh terkandung komposisi garam anorganik, zat pengatur tumbuh, dan bentuk fisik media.  Zat pengatur tumbuh tanaman. Faktor yang perlu diperhatikan dalam penggunaan zat ini adalah konsentrasi, urutan penggunaan dan periode masa induksi dalam kultur tertentu. Lingkungan Tumbuh yang dapat mempengruhi regenerasi tanaman meliputi temperatur, panjang penyinaran, intensitas penyinaran, kualitas sinar, dan ukuran.  Kloning Pada hewan Kloning hewan adalah suatu proses dimana keseluruhan organisme hewan dibentuk dari satu sel yang diambil dari organisme induknya dan secara genetika membentuk individu baru yang identik sama. Artinya, hewan kloning ini adalah duplikat yang persis sama baik dari segi sifat dan penampilannya seperti induknya, dikarenakan adanya kesamaan DNA. Di alam, sebenernya kloning bisa saja terjadi. Reproduksi aseksual pada beberapa jenis organisme dan penemuan mengenai munculnya sel kembar dalam satu telur juga merupakan apa yang disebut dengan kloning. Dengan kemajuan bioteknologi sekarang ini, bukan mustahil untuk menciptakan lebih lanjut mengenai kloning pada hewan.
  • 92. 92 Pertama kali para ilmuwan berusaha membentuk sel kloning pada hewan tidak berhasil selama bertahun-tahun lamanya. Kesuksesan pertama yang diraih oleh ilmuwan pada saat mereka berhasil mengkloning seekor kecebong dari sel embrio di tubuh katak dewasa. Namun demikian, kecebong tersebut tidak pernah berhasil tumbuh menjadi katak dewasa. Kemudian, dengan menggunakan nuclear trasnfer di sel embrio, para ilmuwan mulai melakukan penelitian terhadap kloning hewan mamalia. Tapi sekali lagi, hewan-hewan tersebut tidak pernah mencapai hidup yang panjang. Kloning pertama yang berhasil diujicobakan dan bisa bereproduksi adalah seekor domba yang dinamakan Dolly. Dolly ditemukan oleh Ian Wilmut dan kawan-kawanya di Skotlandia pada tahun 1997. Tapi tidak sama dengan uji coba kloning sebelumnya yang menggunakan sel embrio, kloning dolly menggunakan sel dari domba dewasa. Karena sel domba dewasa ini dianggap sudah tua, maka, dolly pun jadi berumur pendek, walau tidak sependek hewan lain hasil kloningan dengan menggunakan sel embrio. Sekarang ini, para ilmuwan sudah sukses mengkloning banyak hewan seperti tikus, kucing, kuda, babi, anjing, rusa, dan sebagainya dari sel embrio maupun sel non-embrio, tergantung dari tujuan pengkloningan tersebut. Jika, diharapkan hewan hasil kloning yang bisa bereproduksi, maka digunakanlah sel non-embrio, sedangkan jika diharapkan hewan kloning yang tidak harus bisa bereproduksi, maka digunakan sel embrio. Proses kloning hewan melalui tahap berikut, yaitu mengekstrak nukleus DNA dari suatu sel embrio kemudian ditanamkan dalam sel telur yang sebelumnya intinya sudah dihilangkan. Kadang-kadang proses ini distimulasi oleh manusia menggunakan alat dan bahan-bahan kimia. Sel telur yang sudah dibuahi ini kemudian dimasukkan kembali ke dalam tubuh sel hewan inangnya dan membentuk sifat yang identik. Beberapa ilmuwan menjadikan hewan hasil kloningan yang tidak bisa bereproduksi sebagai bahan pangan. Namun baru-baru ini, diberitakan bahwa hewan hasil kloning, tidak layak untuk dikonsumsi sebagai makanan manusia walau belum ada bukti pasti mengenai hal tersebut. Penelitian lebih lanjut mengenai hal ini masih terus dilakukan.
  • 93. 93  Kloning Pada Manusia Setelah sukses dengan teknologi kloning hewan menyusui, sekarang hanya tinggal menunggu waktu, timbulnya kabar yang melaporkan lahirnya manusia hasil kloning. Contohnya saja pada ”Eve”, yang dikabarkan adalah bayi perempuan pertama hasil kloning, namun kebenaran beritanya masih belum bisa dipastikan. Ada lagi berita mengenai hasil kloning permintaan dari pasangan homoseksual dari Belanda. Namun, bukti-bukti konkrit mengenai manusia hasil kloningannya sama sekali tidak ada. Beberapa sumber menyebutkan, para peneliti tersebut beralasan bahwa hal ini menyangkut pribadi sekaligus melanggar privasi dari pendonor gen jika diberitakan secara luas. Mungkin saja, penyembunyian berita-berita seperti ini dilakukan, karena masih banyaknya kontroversi serta pro dan kontra yang terjadi di masyarakat mengenai pengkloningan manusia yang dianggap melanggar kodrat alam dan tidak sesuai dengan etika yang dianut dari agama. Proses kloning pada manusia, sebenarnya tidak memiliki banyak perbedaan dengan bayi tabung atau in vitro fertilization. Dalam proses ini, sperma sang suami dicampur ke dalam telur sang istri dengan proses in vitro di dalam tabung kaca. Setelah sperma tumbuh menjadi embrio, embrio tersebut ditanamkan kembali ke dalam tubuh si ibu, atau perempuan lain yang menjadi ’ibu tumpang’. Bayi yang lahir secara biologis merupakan anak suami-istri tadi, walaupun dilahirkan dari rahim perempuan lain. Proses kloning manusia dapat dijelaskan secara sederhana sebagai berikut:  Mempersiapkan sel stem : suatu sel awal yang akan tumbuh menjadi berbagai sel tubuh. Sel ini diambil dari manusia yang hendak dikloning.  Sel stem diambil inti sel yang mengandung informasi genetic kemudian dipisahkan dari sel.  Mempersiapkan sel telur : suatu sel yang diambil dari sukarelawan perempuan kemudian intinya dipisahkan.  Inti sel dari sel stem diimplantasikan ke sel telur  Sel telur dipicu supaya terjadi pembelahan dan pertumbuhan. Setelah membelah (hari kedua) menjadi sel embrio.
  • 94. 94  Sel embrio yang terus membelah (disebut blastosis) mulai memisahkan diri (hari ke lima) dan siap diimplantasikan ke dalam rahim.  Embrio tumbuh dalam rahim menjadi bayi dengan kode genetik persis sama dengan sel stem donor. 5. Manfaat Kloning  Untuk pengembangan ilmu pengetahuan Manfaat kloning terutama dalam rangka pengembangan biologi, khususnya reproduksi-embriologi dan diferensiasi.  Untuk mengembangkan dan memperbanyak bibit unggul Seperti telah kita ketahui, pada sapi telah dilakukan embrio transfer. Hal yang serupa tentu saja dapat juga dilakukan pada hewan ternak lain, seperti pada domba, kambing dan lain-lain. Dalam hal ini jika nukleus sel donornya diambil dari bibit unggul, maka anggota klonnya pun akan mempunyai sifat-sifat unggul tersebut. Sifat unggul tersebut dapat lebih meningkat lagi, jika dikombinasikan dengan teknik transgenik. Dalam hal ini ke dalam nukleus zigot dimasukkan gen yang dikehendaki, sehingga anggota klonnya akan mempunyai gen tambahan yang lebih unggul.  Untuk tujuan diagnostik dan terapi Sebagai contoh jika sepasang suami isteri diduga akan menurunkan penyakit genetika thalasemia mayor. Dahulu pasangan tersebut dianjurkan untuk tidak mempunyai anak. Sekarang mereka dapat dianjurkan menjalani terapi gen dengan terlebih dahulu dibuat klon pada tingkat blastomer. Jika ternyata salah satu klon blastomer tersebut mengandung kelainan gen yang menjurus ke thalasemia mayor, maka dianjurkan untuk melakukan terapi gen pada blastomer yang lain, sebelum dikembangkan menjadi blastosit. Contoh lain adalah mengkultur sel pokok (stem cells) in vitro, membentuk organ atau jaringan untuk menggantikan organ atau jaringan yang rusak.
  • 95. 95  Menolong atau menyembuhkan pasangan infertil mempunyai turunan Manfaat yang tidak kalah penting adalah bahwa kloning manusia dapat membantu/menyembuhkan pasangan infertil mempunyai turunan. Secara medis infertilitas dapat digolongkan sebagai penyakit, sedangkan secara psikologis ia merupakan kondisis yang menghancurkan, atau membuat frustasi. Salah satu bantuan ialah menggunakan teknik fertilisasi in vitro. (in vitro fertilization = IVF). Namun IVF tidak dapat menolong semua pasangan infertil. Misalnya bagi seorang ibu yang tidak dapat memproduksi sel telur atau seorang pria yang tidak dapat menghasilkan sperma, IVF tidak akan membantu. Dalam hubungan ini, maka teknik kloning merupakan hal yang revolusioner sebagai pengobatan infertilitas, karena penderita tidak perlu menghasilkan sperma atau telur. Mereka hanya memerlukan sejumlah sel somatik dari manapun diambil, sudah memungkinkan mereka punya turunan yang mengandung gen dari suami atau istrinya. 5. Kerugian Kloning 1) Kloning pada manusia akan menghilangkan nasab. 2) Kloning pada perempuan saja tidak akan mempunyai ayah. 3) Menyulitkan pelaksanaan hokum-hukum syara’. Seperti, hokum pernikahan, nasab, nafkah, waris, hubungan kemahraman, hubungan ‘ashabah, dan lain-lain. 4) Memperlakukan manusia sebagai objek. 6. Pandangan Terhadap Kloning  Kloning Gen Ditinjau Dari Hukum Agama Prestasi ilmu pengetahuan yang sampai pada penemuan proses kloning,sesungguhnya telah menyingkapkan sebuah hukum alam yang ditetapkan ALLAH SWT pada sel-sel tubuh manusia dan hewan, karena proses kloning telah menyikap fakta bahwa pada sel tubuh manusia dan hewan terdapat potensi menghasilkan keturunan, jika intisel tubuh tersebut ditanamkan pada sel telur perempuan yang telah dihilangkan inti selnya. Jadi sifat inti sel tubuh itu tak ubahnya seperti sel sperma laki-laki yang dapat membuahi sel telur peermpuan.
  • 96. 96 Pada hakikatnya islam sangat menghargai iptek. Oleh sebab itu islam terhadap kloning tersebut tentunya sangat ditunggu-tunggu oleh masyarakat internasional. Didalam islam berbeda antara hukum kloning binatang dan manusia. Pada hukum kloning pada manusia. Menurut buku fatawa mu’ashiroh karangan Yusuf Qurdhowy bahwa tidak diperbolehkanya kloning terhadap manusia. Atas beberapa pertimbangan diantaranya :  Dengan kloning akan meniadakan keanekaragaman. (varietas). ALLAH SWT telah menciptakan alam ini dengan kaedah keanekaragaman. Hal tersebut tertuang dalam Al-Qur’an surat fathir ayat 26 dan 27. Sedangkan dengan kloning akan meniadakan keanekaragaman tersebut. Karena dengan kloning secara tidak langsung menciptakan duplikat dari satu orang. Dan dengan ini akan dapat merusak kehidupan manusia dan tatanan sosial dalam masyarakat, efeknya sebagian telah kita ketahui dan sebagian lainnya kita ketahui di kemudian hari.  Kloning manusia akan menghilang nasab (garis keturunan). Bagaimana dengan hubungan orang ang mengkloning dan hasil kloningan tersebut, apakah dihukumi sebagai duplikatnya atau bapaknya ataupun kembarannya, dan ini adalah permasalahan yang kompleks. Kita akan kesulitan dalam menentukan nasab hasil kloningan tersebut. Dan tidak menutup kemungkinan kloning dapat digunakan untuk kejahatan, Siapa yang bisa menjamin jikalau diperbolehkan kloning tidak akan ada satu negara yang mencetak ribuan orang yang digunakan sebagai prajurit militer yang berfungsi menumpas negara lain.  Dengan kloning akan mengilangkan Sunatullah (nikah). ALLAH SWT telah menciptakan manusia, tamanan, binatang dengan berpaang-pasangan. Surat Addariyat 46.. Anak-anak produk kloning tersebut dihasilkan melalui cara yang tidak alami. Padahal justru cara alami itulah yang telah ditetapkan ALLAH SWT untuk manusia dan dijadikan-Nya sebagai sunnatullah untuk menghasilkan anak-anak dan keturunannya. ALLAH SWT berfirman: ” dan Bawasannya Dialah yang menciptakan berpasang-pasangan laki-laki dan perempuan, dari air mani apabila dipancarkan.” (QS. An Najm : 45-46).
  • 97. 97  Memproduksi anak melalui proses kloning akan mencegah pelaksanaan banyak hukum-hukum syara’. Seperti hukum tentang perkawinan, nasab, nafkah, hak, dan kewajiban antar bapak dan anak, waris, perawatan anak, hubungan kemahraman, hubungan ’ashabah dan lain-lain. Disamping itu koning akan mencampur adukkan dam menghilangkan nasab serta menyalahi fitra yang telah diciptakan ALLAH SWT untuk manusia dalam masalah kelahiran anak. Kloning manusia sesungguhnya merupakan perbuatan keji yang akan dapat menjungkir balikkan struktur kehidupan masyarakat. Berdasarkan dalil-dalil itulah proses kloning manusia diharamkan menurut hukum islam dan tidak boleh dilahsanakan. ALLAH SWT berfirman mengenai perkataan iblis terkutuk, yang mengatakan : ”...dan akan aku (iblis) suruh mereka (mengubah ciptaan ALLAH), lalu benar-benar mereka mengubahnya.” (QS.An Nisaa’ : 119).  Kloning Ditinjau Dari Hukum Indonesia Ketentuan pidana. : Ketentuan pidana untuk pelaku upaya kehamilan diluar cara alami diatur dalam pasal 82 ayat (2) a yang berbunyi : Melakukan upaya kehamilan diluar cara alami yang tidak sesuai dengan ketentuan sebagaimana dimaksud dalam pasal 10 ayat (2) dipidana dengan pidana penjara paling lama 5 (lima) tahun dan atau denda paling banyak Rp100.000.000,00 (seratus juta rupiah)  Pandangan Etika Terhadap kloning Setelah dilaporkan tentang Dolly, seekor anak domba yang berhasil di klon dari sel domba dewasa. Segera timbul pertanyaan di masyarakat terutama para ahli, apakah nantinya manusia juga akan di klon? Sebab, teknologi ini dapat diterapkan pada semua mamalia termasuk juga manusia. Tetapi dengan demikian munculah masalah etika, yang didasari berbagai pertanyaan seperti apakah yang telah dilakukan dengan hewan ini boleh dilakukan pada manusia? Sejauh manakah manusia dapat dan boleh malangkah ke depan tanpa kehilangan kemanusiaanya?
  • 98. 98 Para ilmuwan berpendapat dan memiliki keyakinan yang besar akan hal ini dapat membantu pasangan yang infertil yang tidak bisa dibantu dengan metode lain untuk bisa mendapatkan keturunan. Dilihat dari tujuan kloning reproduktif yaitu penciptaan manusia baru maka kloning manusia dapat dikatakan tidak etis karena tentu saja hal ini melampaui kekuasaan Tuhan. Dilihat dari tujuan kloning dikatakan etis apabila digunakan untuk tujuan kesehatan atau tujuan klinik. Penelitian yang berlangsung menyangkut diri manusia harus bertujuan untuk menyempurnakan tata cara diagnostic, terapeutik dan pencegahan serta pengetahuan tentang etiologi dan tatogenesis. Dan juga kloning tidak disalahgunakan untuk kepentingan pribadi yang dari pengembangannya untuk tujuan ekonomi, militerisme dan tindakan-tindakan kriminal.